$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Tri manuel des neurones de souris marqués par fluorescence
- Tirez les microcapillaires en verre (voir le tableau des matériaux) à un diamètre de sortie de 10 à 15 μm à l’aide d’un extracteur capillaire avec les réglages suivants : chaleur : 508, traction : blanc, vel : blanc, temps : blanc.
- Fixez un tube flexible en silicone de 120 à 150 cm (~0,8 mm de diamètre intérieur) à un filtre à seringue à membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) de 0,2 μm et à un robinet de tube à deux voies à l’aide de connecteurs de tube appropriés.
- Préparez 500 ml de liquide céphalo-rachidien artificiel réfrigéré (4 °C) (ACSF, tableau 1) et oxygénez en faisant bouillir de l’oxygène équilibré à 5 % de dioxyde de carbone à travers une pierre à air pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que la solution soit complètement éclaircie.
- Préparez 100 mL d’ACSF avec un cocktail de bloqueurs d’activité dans un bécher de 150 mL (tableau 1).
- Préparer 100 mL d’ACSF avec 1 mg/mL de protéase de streptocoque fraction IV dans un bécher de 150 mL (tableau 1).
- Préparez 100 ml d’ACSF avec une solution de sérum de veau fœtal à 1 % dans un bécher de 150 ml et oxygénez avec 5 % d’oxygène équilibré en dioxyde de carbone à l’aide d’une pierre à air.
- Disséquez le cerveau d’une souris euthanasiée en ouvrant le crâne avec un petit ciseau et en extrayant le cerveau frais à l’aide de pinces fines sans endommager le cortex.
note: Les souris de n’importe quelle souche, âge et sexe peuvent être utilisées à volonté. Ne pas congeler le cerveau ou effectuer un tri manuel sur des souris injectées de virus ou d’autres agents dangereux/infectieux.
- Gardez le cerveau dans de l’ACSF réfrigéré et oxygéné, en laissant une pierre à air attachée à 5 % de dioxyde de carbone équilibre l’oxygène pendant toute la durée de la section.
- Positionnez le cerveau sur le mandrin vibratome et coupez des sections coronales ou sagittales à 300 μm d’épaisseur. Collectez autant de sections que nécessaire pour obtenir un minimum de ~10 à 50 cellules marquées jusqu’à plusieurs centaines de cellules. Placez les tranches sur un porte-tranches en maille de coton, placé à l’intérieur d’un bécher de manière à ce qu’elles soient baignées dans de l’ACSF oxygéné.
- Déplacez les tranches fraîches dans un bécher contenant de l’ACSF avec des bloqueurs d’activité et bloquez pendant 15 à 20 minutes à température ambiante. Continuez à faire bouillonner l’oxygène à l’aide de la pierre à air.
- Déplacez les tranches dans un bécher contenant de l’ACSF avec la solution de protéase pour effectuer une digestion douce à température ambiante : 20 à 30 min pour les animaux P4-14 ou jusqu’à 45-60 min pour les animaux P28-56. Continuez à faire bouillonner l’oxygène.
- Rincer l’ACSF avec de la protéase en remettant les tranches dans le bécher contenant une solution de bloqueurs d’activité pendant 5 à 10 minutes à température ambiante. Continuez à faire bouillonner l’oxygène.
- Déplacer les sections individuelles dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant de l’ACSF avec 1 % de FBS à température ambiante. Sous une lunette de dissection fluorescente, microdissectionz les zones et les couches d’intérêt ayant un minimum de 10 à 50 cellules (jusqu’à quelques centaines). Effectuez la microdissection à l’aide d’une pince fine ou en fixant des aiguilles d’injection de 22 à 28 G sur des supports en bois (brochettes).
- À l’aide d’une pipette Pasteur, déplacer les morceaux microdisséqués dans un tube de microfuge de 2 mL contenant ~0,8 mL de FBS à 1 % dans une solution d’ACSF.
- Triturez le tissu disséqué dans le tube de microfuge à température ambiante. Réalisez trois pipettes Pasteur à longue tige avec des diamètres de sortie décroissants en les faisant rouler sur une flamme nue. Effectuez ~10 coups avec chaque pipette, en commençant par la plus grande et en terminant par la plus petite.
- Distribuez les cellules dissociées dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant de l’ACSF oxygéné (la boîte de Pétri peut être recouverte d’une fine couche de 5 mm de gélose à 1 % ou d’un composé de silicone transparent dans un rapport de 1:10, si vous le souhaitez). Conserver à température ambiante.
- Attendez ~5-7 min que les cellules se stabilisent progressivement, puis observez le signal GFP/RFP sous un microscope de dissection.
note: Les cellules individuelles, les débris et les petits amas seront visibles en fond clair (BF).
- Prélevez 10 à 15 cellules GFP/RFP à la fois à l’aide d’une pipette capillaire (à partir de l’étape 1.1) fixée à un tube en silicone flexible (diamètre intérieur de 0,4 à 0,8 mm) et distribuez les cellules dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant de l’ACSF fraîchement oxygéné.
- En bloquant l’extrémité de la valve de la tubulure avec la languette, positionnez le capillaire près de la cellule d’intérêt. Capturez les cellules par capillarité lors de la libération du bloc, puis bloquez-les à nouveau rapidement pour empêcher l’excès de liquide de pénétrer dans la pipette. Versez les cellules dans une boîte de Pétri de 100 mm avec de l’ACSF fraîchement oxygéné en soufflant doucement, tout en observant l’extrémité capillaire sous l’optique de fluorescence du microscope de dissection. Essayez de collecter ~100 à 150 cellules au total.
- Répétez l’étape 1.19 une ou deux fois de plus (en fonction des débris) et transférez un total de ~50 à 75 cellules dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm, en vous assurant que les contaminants tels que les débris sont minimes dans les optiques à contraste interférentiel différentiel (CID) en fond clair.
Table 1 : Liste des solutions et des tampons.
| tampon | article | concentration | Quantité (μL) |
| Tampon de collecte d’échantillons | Inhibiteur de la ribonucléase recombinante | | 55 |
| Rcc | 1:50K dilué | 110 |
| Eau sans nucléases | | 605 |
| Aliquote 43,75 μL de ce qui précède dans 16 tubes (2 bandelettes de 8 ; tubes PCR de 200 μL) ; ajouter ce qui suit par tube |
| Amorces UMI (par ex. N10B1-N10B16) | 1 ng/μL | 6,25 μL/tube |
| Volume final dans chaque tube 50 μL (chaque tube peut être divisé en aliquotes de 25 μL et congelé à -80 °C) |
| Solutions: | article | concentration | quantité |
| LCR : pour faire dissoudre 5 L | NaCl | 126 millions d’euros | 36,8 grammes |
| Kcl | 3 millions d’euros | 1,15 g |
| NaH2PO4 | 1,25 million d’euros | 0,75 g |
| NaHCO3 | 20 millions d’euros | 8,4 grammes |
| À 500 mL d’ACSF, buller d’oxygène pendant 10-15 min puis ajouter ce qui suit frais à chaque fois : |
| D-glucose | 20 millions d’euros | 1,8 g |
| MgSO4 | 2 millions d’euros | 0,5 mL à partir de 4 M de stock |
| CaCl2 | 2 millions d’euros | 0,5 mL à partir de 4 M de stock |
| Garder l’ACSF oxygéné tout au long de l’activité |
| Solutions: | article | Concentration |
| Cocktail bloqueur d’activité : faire un stock 100x |
| À 100 mL d’ACSF, ajouter | | |
| L’APV | 0,05 million d’euros | |
| CNQX | 0,02 million d’euros | |
| Le TTX | 0,0001 mM (0,1 μM) |
| Solutions: | article | quantité | |
| Dose de protéase (100 mL) | Protéase de Streptomyces griseus | 100 mg | |
| Sérum fœtal bovin : source commerciale, aliquote en 500 μL pour chaque utilisation. |