1. Récolte et culture de cellules de lignée OL (OL)
REMARQUE : Ces étapes doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
- Le lendemain de l’agitation, préparez le milieu Bottenstein-Sato (BS) selon le tableau 1.
- Rincez 3 fois les boîtes de Pétri enrobées avec de l’eau distillée stérile.
- Récoltez le surnageant des flacons contenant principalement des cellules de la lignée OL mais aussi quelques cellules microgliales et placez-le sur des boîtes de Pétri non enrobées de 100 mm.
note: Cette étape permet l’élimination des cellules microgliales par adhérence rapide différentielle à la surface de la parabole.
- Incuber les boîtes de Pétri pendant 15 min dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Remplissez chaque fiole T150 avec 25 mL de milieu de culture chaud et fraîchement préparé et incubez dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5 % de CO2 jusqu’à la deuxième agitation.
- Transférez le surnageant des boîtes de Pétri dans de nouvelles boîtes de Pétri non revêtues de 100 mm pour permettre l’adhésion des cellules microgliales résiduelles.
- Incuber les boîtes de Pétri pendant 15 min dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Retirez le surnageant, qui contient des cellules de lignée OL non adhérentes, et transférez-le dans des tubes de 50 ml (surnageant provenant de 2 boîtes de Pétri pour un tube de 50 ml). Jeter les boîtes de Pétri plaquées avec des microglies.
- Centrifuger le surnageant pendant 5 min à 423 x g. Retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu BS. Regrouper tous les granulés dans un tube commun de 50 ml et ajuster le volume à 10 ml avec un milieu BS.
- Déterminer la densité cellulaire en comptant les cellules au microscope.
note: Une densité cellulaire comprise entre 3 x 105 cellules/mL et 5 x 105 cellules/mL doit être obtenue.
- Ajouter 20 mL de BS si la densité cellulaire est supérieure ou égale à 4 x 105 cellules/mL pour obtenir un volume final de 30 mL, ou ajouter seulement 10 mL de BS si la densité cellulaire est inférieure à 4 x 105 cellules/mL pour obtenir un volume final de 20 mL.
- Plaquez deux ou trois boîtes de Pétri pré-enduites de 100 mm avec 10 mL de suspension cellulaire. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Nettoyez les débris des boîtes de Pétri en rafraîchissant tout le milieu BS 2 h plus tard.
note: Examinez la culture au microscope avant et après l’éclaircie pour vérifier la densité cellulaire et l’efficacité de l’élimination des débris.
- Incuber pendant 2 jours en milieu BS dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5 % CO2.
note: Examinez la culture au microscope. La confluence devrait être de 70 % à 80 %.
2. Production d’OCM
REMARQUE : Effectuez ces étapes dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
- Préparez le NB-B27low medium conformément au tableau 2.
- Renouveler le milieu de culture avec 10 ml de milieu chaud NB-B27low. Incuber pendant 2 jours dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Récoltez l’OCM, c’est-à-dire le surnageant contenant les facteurs sécrétés par l’OL. Stérilisez l’OCM à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
note: Conserver l’OCM à 4 °C pendant 2 mois maximum.
Tableau 1 : Préparation des milieux Bottenstein-Sato (BS).
| Médias Bottenstein-Sato (BS) | Concentration finale |
| Aigle modifié de Dulbecco Medium | |
| Pénicilline-streptomycine | 100 UI/mL |
| apo-Transferrin humain | 100 μg/mL |
| BSA (albumine sérique bovine) | 100 μg/mL |
| insuline | 5 μg/mL |
| PDGF | 10 ng/mL |
| progestérone | 62 ng/mL |
| Chlorhydrate de putrescine | 16 μg/mL |
| Sélénite de sodium | 40 ng/mL |
| T3 (sel sodique de 3,3',5-Triiodo-L-thyronine) | 30 ng/mL |
| T4 (L-thyroxine) | 40 ng/mL |
Tableau 2 : Préparation des milieux NB-B27low et NB-B27.
| NB-B27 Faible média | Concentration finale |
| Neurobasale | |
| Supplément B27 | 0,5 fois |
| L-glutamine | 0,5 million d’euros |
| Pénicilline-streptomycine | 100 UI/mL |
| Supports NB-B27 | Concentration finale |
| Neurobasale | |
| Supplément B27 | 1x |
| L-glutamine | 0,5 million d’euros |
| Pénicilline-streptomycine | 100 UI/mL |
