- Culture compartimentée de ganglions de la racine dorsale (DRG), d’oligodendrocytes (OPC) et de hGC (cellules de gliome humain) de rat
1. Préparation des boîtes de culture compartimentées
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes les jours précédant la récolte prévue des DRG.
- Assemblez des plats de culture compartimentés.
- Diluer la solution mère de collagène à 500 μg/mL dans du H2O distillé stérile ; bien mélanger.
- À l’aide d’une pipette de transfert stérile, remplissez une boîte de culture de 35 mm avec 2 ml de solution de collagène, retirez la solution, en laissant une fine pellicule de collagène, et placez-la dans la boîte suivante de 35 mm. Répétez ce processus, en ajoutant plus de solution de collagène si nécessaire, jusqu’à ce que tous les plats aient été enrobés.
- Une fois que toutes les plaques sont enduites, placez les plaques dans un plateau de culture de 245 mm x 245 mm et posez trois compresses de gaze de 1 mm x 1 mm au centre du plateau.
- Pour polymériser le collagène, mouillez des compresses de gaze avec 1 ml d’hydroxyde d’ammonium concentré et couvrez les plateaux pendant 15 min.
- Retirez les tampons de gaze et laissez sécher la vaisselle de 35 mm dans la hotte à flux laminaire.
- Pendant que la vaisselle sèche, chargez le cylindre de l’applicateur de graisse de seringue avec de la graisse sous vide poussé. Placez les chambres compartimentées dans une grande bouteille de support à bouche remplie d’eau distillée. Stérilisez à la fois par autoclave et laissez refroidir.
- Limez la pointe d’une aiguille de 18 G pour en faire une pointe émoussée. Stériliser à l’éthanol à 70 %. Fixez l’aiguille à la seringue à graisse.
- Stérilisez le râteau à goupilles en le trempant dans de l’éthanol à 70 % ; laissez-le sécher à l’air libre dans la hotte à flux laminaire.
- Retirez le couvercle d’un plat sec de 35 mm recouvert de collagène. Tenez le plat entre le pouce et l’index. Tenez le râteau à goupilles de l’autre main. Appliquez une pression ferme pour créer des rayures de 200 μM de large au centre de la parabole.
- À l’aide d’une pipette de pâturage, placez deux gouttes de milieu basal neuronal supplémenté au centre des égratignures.
- Répétez les étapes 1.1.10-1.1.11 jusqu’à ce que toute la vaisselle ait été grattée.
- Sécher les chambres compartimentées dans une hotte à flux laminaire.
- À l’aide d’une pince hémostatique stérile, saisissez une chambre compartimentée par le séparateur central. Retournez la pince hémostatique de manière à ce que le bas de la chambre soit vers le haut.
- Appliquez de la graisse silicone dans la chambre compartimentée, en commençant par le haut. Assurez-vous que la graisse est bien placée et qu’elle se chevauche dans tous les coins.
- Retirez le couvercle d’un plat de 35 mm. Retournez le plat et placez les rayures sur la chambre. Tapotez doucement le bas de l’assiette à l’aide d’une pince.
- Retournez doucement la plaque à l’aide de la pince hémostatique. Relâchez la pince.
- Placez un monticule de graisse à la base du compartiment central. Remplissez chaque chambre avec du milieu basal neuronal (NB) supplémenté et vérifiez s’il y a des fuites. Scellez les fuites avec de la graisse silicone au besoin.
- Continuez à assembler toutes les boîtes de culture et conservez-les toute la nuit à 37 °C, 5 % de CO2.
