Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des solutions et des matériaux
- Préparez la solution de Ringer en mélangeant 123,3 mM de NaCl, 1,53 mM de CaCl2, 4,96 mM de KCl, 0,809 mM de Na2HPO4 et 0,147 mM de KH2de PO4 (voir le tableau des matériaux). Ajustez le pH à 7,4 et filtrez la stérilisation dans des bouteilles de 100 ml. Conserver dans un endroit propre et sec. Ne pas laver les bouteilles avec du savon (traiter comme de la verrerie de culture tissulaire).
- Préparer une solution mère de fibronectine (FN) à 1 mg/mL (voir le tableau des matières) en dissolvant la FN dans une solution stérile de Ringer et la conserver dans des aliquotes de 100 μL à -80 °C (stable pendant au moins 4 ans).
- Préparez un milieu de culture complet en complétant le milieu L15 avec 0,8 % de L-glutamine, 0,08 % de pénicilline/streptomycine, 10 % de FBS et 10 % d’extrait d’embryon de poulet. Créer des aliquotes de 3 mL et les conserver à -20 °C ou -80 °C.
note: Si les cultures sont incubées dans un incubateur de CO2, le milieu Eagle F12 modifié de Dulbecco (DMEM/F12) doit être substitué au L15, qui est tamponné pour l'air.
- Préparez des cadres de support en papier filtre (rectangles de papier d’environ 1 cm x 1,5 cm avec deux ou trois trous perforés qui se chevauchent sur l’axe long).
- Percez des trous le long du bord d’un grand morceau de papier filtre à l’aide d’une perforatrice standard à trois trous, coupez/coupez le bord perforé en une bande, puis coupez la bande entre les trous en rectangles de ~ 1,5 cm de longueur. Papiers filtres autoclaves avant utilisation (facultatif).
- Rassemblez des outils de dissection, y compris des pinces fines (#5), des pinces émoussées, des ciseaux de dissection, des ciseaux à ressort et des aiguilles en tungstène aiguisées.
2. Préparation des plats de culture
- Choisir des boîtes de culture de plis neuraux (voir la table des matériaux) appropriées pour l’application en aval.
- Pour les cultures qui seront fixées et colorées, utilisez des lamelles en verre placées dans des boîtes de culture de tissus multi-puits.
note: Les lamelles qui correspondent à la taille du puits bougeront moins avec le mélange des fluides, ce qui rend les explants moins susceptibles de se déplacer et plus susceptibles d’adhérer à la lamelle plutôt qu’au fond de la parabole.
- Choisissez des plats à chambre unique ou à chambre divisée à fond de verre (voir le tableau des matériaux) pour l’imagerie en direct avec un microscope inversé.
- Pour l’imagerie en direct sur un microscope droit ou stéréoscopique, utilisez des plaques de culture tissulaire à 6, 12 ou 24 puits optiquement appropriées.
- Sélectionner des boîtes de culture de tissus en plastique pour la collecte massive de cellules de crête neurale migratrice pour des analyses à haut débit.
- Ajouter 10 μg/mL de pénicilline et 10 μg/mL de streptomycine dans une bouteille de 100 mL de solution stérile de Ringer (par exemple, 100 μL de pénicilline 10 000 μg/mL de pénicilline et 10 000 μg/mL de streptomycine, pour obtenir la P/S de Ringer). Utilisez le P/S de Ringer dans un délai de 1 semaine.
- Décongeler une aliquote de 1 mg/mL de FN sur de la glace. Diluer avec le P/S de Ringer à une concentration de 10 à 100 μg/mL de FN.
- Pipetez suffisamment de solution FN pour couvrir le fond du puits ou du plat. Par exemple, 100 μL par puits dans une plaque de 24 puits, 500 μL pour une parabole de 35 mm.
- Replacez le couvercle et incubez les plats ou les assiettes avec la solution de FN dans un incubateur humidifié (ou un plateau couvert avec des essuie-tout imbibés d’eau distillée) à 38 °C (100 °F) pendant au moins 1 h tout en disséquant les plis neuraux.
3. Dissection des plis neuraux
- Transférez un embryon dans une boîte propre contenant la solution P/S de Ringer et rincez l'embryon en tenant le cadre en papier filtre avec une pince et en agitant doucement d'avant en arrière pour éliminer tout jaune qui obscurcit la vue de l'embryon. Remplacez le P/S de la sonnerie ou transférez-le dans un plat frais s'il devient trouble.
- Positionnez la face dorsale/la monture de l’embryon vers le haut sous un microscope à dissection. En laissant l’embryon sur le cadre en papier pour le maintenir tendu et maintenu en place, retirez la membrane vitelline à l’aide d’une pince pour exposer les plis neuraux.
note: Si l’embryon tombe du cadre en papier, il peut être disposé à plat dans la boîte ou épinglé à une boîte recouverte de sylgard pour la dissection.
- À l’aide de ciseaux à ressort ou d’une aiguille en tungstène aiguisée, excisez soigneusement les plis neuraux du mésencéphale. Inclure le tissu caudal aux vésicules optiques en expansion et le rostral au cerveau postérieur, où les constrictions rhombomères commencent tout juste à apparaître (le croissant cardiaque est également un indicateur utile, figures 1B, C). Prenez soin d’exciser la face la plus dorsale du pli neural avec un tube neural et un ectoderme non neural contaminant au minimum (Figure 1C).
- Transférez les plis neuraux dans une boîte propre contenant le P/S de Ringer à l'aide d'une pipette P20 ou d'une pipette Pasteur en verre stérile rincée avec du P/S de Ringer jaune (cela bloque le plastique ou le verre pour éviter que le tissu ne colle). Rangez les plis collectés sur de la glace pendant que vous disséquez des plis supplémentaires.
4. Placage des plis neuraux
- Décongeler une aliquote du milieu de culture complet (section 1, étape 3). Ajouter 100 μg/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine et stériliser par filtre. Conservez le support préparé à 37-38 °C pendant que vous effectuez les autres étapes.
- Retirer les boîtes de culture de l’incubateur (section 2, étape 5). À l’aide d’une pipette ou d’une pipette Pasteur, prélevez la solution FN des lamelles, des plats ou des puits. Après avoir rincé le substrat revêtu de FN avec le P/S de Ringer, ajoutez un volume approprié de milieu de culture complet dans les boîtes ou les puits (500 μL pour les puits dans une plaque à 24 puits, 2 mL pour une boîte de 35 mm ou une plaque à six puits).
note: De plus petits volumes peuvent conserver des réactifs coûteux (par exemple, aussi bas que 200 μL pour une plaque à 24 puits), mais garantir que la boîte est suffisamment humidifiée pour éviter l’évaporation.
- À l'aide d'une pipette p20 ou p200, rincez d'abord la pointe de la pipette avec le P/S de Ringer jaune d'œuf pour bloquer le plastique et empêcher le tissu de coller. Ensuite, transférez les plis neuraux isolés sur les lamelles revêtues de FN, en prenant soin de transférer le moins possible le P/S de Ringer. Placez le(s) pli(s) vers le centre de la lamelle revêtue FN.
note: Un ou quelques plis neuraux peuvent être plaqués sur une lamelle de 12 mm dans un puits de 19 mm, jusqu’à 50 sur une plaque de 35 mm.
- Après avoir laissé les explants se déposer pendant 10 à 15 minutes, placez-les dans une chambre humidifiée à 38 °C (100 °F) en portant lentement et soigneusement les boîtes de culture avec des plis neuraux plaqués. Cela minimisera le déplacement des plis neuraux dans les puits, en veillant à ce qu’ils restent dispersés et adhèrent à toutes les lamelles.
note: Lors de l’utilisation de L15 (pas de DMEM), les plats de culture d’explants peuvent également être incubés dans un incubateur d’œufs à l’aide d’un plateau couvert d’essuie-tout humidifié.
- Incuber des cultures de plis neuraux dans l’incubateur humidifié pendant la durée de la migration active (environ 16 à 20 h au total, figure 2).
