Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparatifs
REMARQUE : Les solutions et outils décrits dans cette section peuvent être élaborés bien à l’avance et utilisés le jour de la dissection et de l’enregistrement.
- Préparez le milieu Liebovitz complété par 10 mM de HEPES (solution L-15). Les étapes suivantes décrivent la préparation de 1 L de solution L-15.
- Verser 990 mL de H2O déminéralisé dans un bécher. Mesurer et ajouter 2,386 g (10 mM) de HEPES. Ajouter un flacon de 1 L de solution de L-15 en poudre.
REMARQUE : Le L-15 en poudre a une durée de conservation plus longue et prend moins d’espace de stockage. Vous pouvez également acheter la solution L-15 et compléter avec HEPES. Cette dernière option a également la possibilité d’utiliser une solution sans phénol, ce qui est utile pour l’imagerie par fluorescence.
- Remuez la solution sur une plaque à mélanger. À l’aide d’un pH-mètre, ajoutez lentement 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH) pour obtenir un pH compris entre 7,34 et 7,36.
- Ajouter du H2O désionisé jusqu’à ce que la solution atteigne un volume de 1 000 mL. Filtrez la solution à l’aide d’une membrane de pores de 0,22 μm.
note: La solution de L-15 peut être conservée à 4 °C pendant 1 à 2 semaines. Si vous utilisez du L-15 fabriqué avec du rouge de phénol, la solution deviendra rose si elle est trop basique (pH > 7,4) ou orange si elle est trop acide (pH < 7,34).
- Préparez le milieu de culture pour les neurones ganglionnaires vestibulaires (VGN). Suivez les étapes ci-dessous pour fabriquer 50 ml de milieu de culture :
- Ajouter 47,5 ml de milieu essentiel minimum GluMAX-I dans un bécher en verre propre.
- Mesurer et ajouter 0,1194 g (10 mM) de HEPES. Ce tampon supplémentaire résiste aux changements de pH pendant que les cellules se déposent avant d’être déplacées vers l’incubateur.
- Ajouter 2,5 mL de sérum fœtal bovin (FBS). Cela fait 5 % en volume de FBS dans un volume total de 50 mL de milieu.
- Remuez la solution sur une plaque à mélanger. À l’aide d’un pH-mètre, ajoutez lentement 1 N de NaOH pour obtenir un pH compris entre 7,38 et 7,4.
- Ajouter 0,5 mL de pénicilline-streptomycine. Filtrez la solution à travers un filtre stérile de 0,22 μm. Conserver la solution à 4 °C.
- Au moins 30 min avant l’utilisation, transvaser le milieu de culture dans une fiole de culture tissulaire muni d’un capuchon ventilé. Placer le ballon avec le milieu de culture dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.
2. Fabrication de pipettes de trituration
REMARQUE : Les pipettes de trituration peuvent être réutilisées pour plusieurs expériences. Rincez les pipettes avec de l’éthanol, de l’eau et une solution de L-15 avant chaque utilisation et nettoyez-les avec de l’eau et de l’éthanol après chaque utilisation. Rangez soigneusement entre les utilisations.
- Pour préparer des pipettes de trituration pour la dissociation cellulaire, tenez une pipette Pasteur en verre à la flamme d’un bec Bunsen. Une fois que la pointe du verre commence à fondre, étirez le verre jusqu’au diamètre de pointe souhaité. Tirez une extrémité de la pipette loin de la flamme pour créer une petite courbure.
- Approchez la pipette courbée d’un microscope. À l’aide d’une tuile incisatrice, marquez et cassez le verre au diamètre souhaité.
- Passez la pointe de la pipette sur le dessus de la flamme du bec Bunsen. Cela permettra de polir rapidement les bords rugueux près de la pointe. Assurez-vous que l’embout n’est pas scellé par la flamme.
- Répétez l’opération jusqu’à ce que quatre ou cinq pipettes de tailles différentes aient été préparées.
3. Extraction du ganglion vestibulaire et placage des neurones vestibulaires
- Préparation à la dissection
- Préparez un mélange enzymatique d’une solution de L-15 avec 0,05 % de collagénase et 0,25 % de trypsine. Par exemple, ajoutez 0,001 g de collagénase et 0,005 g de trypsine à 2 ml de solution de L-15 dans un bécher, ajoutez un petit agitateur magnétique et remuez jusqu’à ce que le tout soit bien mélangé. Réserver à température ambiante.
- Préparez une guillotine obtenue dans le commerce en plaçant des serviettes en papier sur le côté et sous la guillotine afin de minimiser l’exposition de la paillasse et d’autres surfaces au sang et à d’autres matières biologiques.
- Disposez de grandes ciseaux en acier inoxydable, de grandes pinces et de grandes ciseaux à ressort. Gardez un grand flacon pulvérisateur avec 70 % d’éthanol à portée de main pour le nettoyage de la tête.
- Remplissez un bécher de 100 mL avec la solution L-15 et placez-le sur de la glace. Oxygéner la solution L-15.
- Disposez les ciseaux à ressort, les ciseaux chirurgicaux, la pince, le scalpel et la pipette de transfert (voir tableau des matériaux).
- Préparez une boîte de Pétri de 60 mm (pour la dissection macroscopique) et deux boîtes de Pétri de 35 mm (pour le nettoyage/dissection fine des ganglions). Remplissez la boîte de 60 mm avec une solution oxygénée de L-15 à l’aide d’une seringue de 30 mL munie d’un embout filtrant de 0,22 μm.
- Euthanasie, nettoyage de la tête et hémisection
- Peser les petits pour calculer la dose appropriée de dilution fatale plus à administrer par voie intrapéritonéale (~0,01 mL par 10 g).
- Une fois qu’un plan d’anesthésie profond est atteint, évalué par une absence de réponse au pincement de l’orteil, décapitez à l’aide de la guillotine.
- Rincez abondamment la tête avec de l’éthanol à 70 %, puis abondamment avec une solution de L-15.
- Retirez complètement la peau du crâne. Coupez la tête en deux à l’aide de gros ciseaux à ressort en commençant par le point d’entrée de la moelle épinière vers le cerveau et en faisant deux coupes, la première coupée à travers le haut du crâne et la seconde à travers le bas de la mâchoire. Terminez de couper la tête en deux à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Placez les deux moitiés de la tête, côté cerveau vers le bas, dans une boîte de Pétri de 60 mm remplie de solution L-15. Placez le tissu frais qui n’est pas en cours de dissection sur de la glace.
- Extraction du ganglion vestibulaire supérieur
- Retirez le cerveau à l’aide de ciseaux chirurgicaux fermés. Sectionner et enlever le nerf crânien pour détacher complètement le cerveau du crâne.
note: À ce stade, la capsule otique (en forme de chiffre 8) doit être visible à l’arrière de la tête.
- À l’aide d’une pince et en commençant par l’arrière de la tête, retirez le matériau membraneux transparent.
- Découpez le haut du crâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Retirez l’excès de tissu à l’arrière de la tête et du cou pour rendre la zone de dissection et la capsule otique plus propres et plus faciles d’accès.
note: Évitez de rendre le plat trop trouble en jetant l’excès de tissu tout au long de la procédure.
- Transférez le tissu dans une deuxième boîte de Pétri avec une solution fraîche de L-15. Localisez la capsule otique et les nerfs vestibulaires auditif, vestibulaire supérieur et vestibulaire inférieur. Coupez le nerf auditif et séparez les ganglions supérieurs et inférieurs à l’aide de petits ciseaux à ressort.
note: Bien que les somates du nerf vestibulaire se trouvent à la fois dans les ganglions inférieurs (plus minces) et supérieurs (plus épais), les cellules extraites du ganglion supérieur ont une meilleure survie.
- À l’aide d’un scalpel, rasez doucement la crête osseuse pour affaiblir la zone osseuse sous laquelle le nerf plonge dans la capsule osseuse. Retirez soigneusement les débris à l’aide d’une pince fine, exposant toute la partie enflée du ganglion.
- Utilisez les ciseaux à ressort fins pour couper et séparer le ganglion de la branche nerveuse périphérique qui plonge vers l’utricule.
- Retirez le ganglion supérieur à l’aide d’une pince fine, en veillant à ne pas pincer trop près du tissu ganglionnaire. Transférer dans une boîte de Pétri de 35 mm avec une solution de L-15 fraîche.
- Avant de continuer, préchauffez la solution enzymatique : versez le mélange d’enzymes dans une boîte de Pétri de 35 mm et placez-le dans un incubateur à 37 °C pendant 10 à 15 min.
- Nettoyez le ganglion à l’aide de pinces fines et de petits ciseaux à ressort en enlevant l’os (qui apparaît blanc et cristallisé dans sa structure), l’excès de tissu, les fibres nerveuses et toute autre structure superflue. Prenez soin de minimiser l’ablation de tout tissu ganglionnaire.
- Dissociation et placage des tissus
- Transférez les ganglions nettoyés dans la solution enzymatique préchauffée et remettez-la dans l’incubateur pendant 10 à 40 min. Le traitement enzymatique est terminé une fois que le tissu commence à se décomposer, mais reste en un seul morceau. Un traitement excessif du tissu avec des enzymes entraînera la dissolution complète des ganglions avant la trituration.
REMARQUE : La durée du traitement enzymatique dépend de l’âge de l’animal. Par exemple, les ganglions de rats P9 sont traités avec une enzyme pendant 25 min, et les ganglions de rats P15 sont traités avec une enzyme pendant 35 min.
- Transférez les ganglions dans la boîte de Pétri de 35 mm avec une solution fraîche de L-15 et incubez pendant 2-3 min.
- Transférez les ganglions dans une autre boîte de Pétri de 35 mm remplie de milieux de culture filtrés.
- À l’aide d’une micropipette de 200 μL, pipetez une goutte de ~150 μL de milieu de culture filtré sur une boîte à fond de verre revêtue. N’ajoutez pas trop de solution, car il est important de maintenir une tension superficielle pour former une bulle de solution qui reste sur la lamelle en verre.
- Transférez le nombre souhaité de ganglions (un à quatre) sur la lamelle.
- Prélevez une petite quantité de milieu de culture dans la boîte de culture pour rincer la pipette de trituration avec un produit afin d’éviter que le tissu ne colle aux côtés de la pipette en verre. Triturez en passant doucement et à plusieurs reprises le tissu dans la pipette jusqu’à ce que les ganglions soient suffisamment dissociés.
note: Ne travaillez pas trop le tissu pour tenter des suspensions unicellulaires ou ne laissez pas les cellules s’écraser au fond de la boîte en utilisant une pression positive excessive. Évitez également de former des bulles d’air, car cela réduira la survie cellulaire. Une trituration douce est la clé d’une survie cellulaire réussie.
- Laissez reposer les cellules pendant 5 min. Vérifiez au microscope optique si les cellules se sont déposées sur la lamelle.
- Placez délicatement une boîte de culture dans un incubateur à 37 °C pendant 12 à 24 h. Encore une fois, assurez-vous de garder la bulle de solution intacte.
note: Si la culture dure plus de 24 h, rafraîchissez le milieu de culture tous les jours. Cela peut être un point de pause possible.
