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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Dissociation tissulaire
REMARQUE : Toutes les procédures suivantes sont effectuées dans une enceinte de biosécurité désignée pour la culture de tissus stériles à l’aide d’une technique aseptique et de matériaux stériles.
- Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % contenant 0,53 mM d’EDTA à chaque tube conique de 15 mL de DMEM et au tissu pour commencer la lyse des tissus.
note: Le DMEM contient une grande quantité de chlorure de calcium, qui peut agir comme un inhibiteur de la trypsine. Si la dissociation n’est pas complète en suivant les étapes décrites, la solution saline équilibrée de Hanks sans calcium ni magnésium peut être utilisée. Après la trypsinisation, l’enzyme peut être neutralisée par l’ajout d’un inhibiteur de la trypsine, bien que le calcium doive être rajouté à la solution car il s’agit d’un cofacteur de la DNase I, qui est utilisée dans les étapes suivantes.
- Triturer avec une pipette de 10 mL environ 20x.
- Transférez les suspensions de cellules dans des tubes coniques vides de 50 ml.
- Incuber la solution à 37 °C, 5 % CO2 pendant 15 min, en agitant doucement les lysats après 8 min.
- Ajouter 5 mL de MGM et 200 μL (5 mg/mL) de DNase I dans chaque tube pour une concentration finale de 50 μg/mL.
- Triturez chaque lysat à l’aide d’une pipette de 10 mL 10x.
- Laissez les suspensions cellulaires reposer pendant 3 minutes à température ambiante pour permettre aux tissus non dissociés de se déposer au fond des tubes.
- Transférez les suspensions cellulaires dans de nouveaux tubes coniques de 50 ml, en laissant derrière vous le tissu non dissocié.
note: Les étapes de lyse et de trituration décrites ci-dessus limitent significativement la quantité de tissu non dissocié.
- Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 3 min à 4 °C sans freiner.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles de cellules restantes dans 5 mL de MGM.
- Triturez la pastille avec une pipette de 5 mL 20x.
- Déposer les suspensions cellulaires de 5 mL sur des fioles T25 enrobées.
- Incuber les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 et changer de milieu après 24 h pour éliminer les débris cellulaires.
note: Certains protocoles recommandent un premier changement de support après 72 h. Une optimisation de cette étape peut être nécessaire.
- Effectuez un changement de milieu de 100 % avec MGM toutes les 48 à 72 h jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80 % (environ 5 à 7 jours).
REMARQUE : Tous les supports doivent être chauffés à 37 °C avant de changer de support.
2. Isolement de cellules précurseurs d’oligodendrocytes
Lors de l’enrobage des OPC après l’isolement initial, ils doivent être plaqués sur une surface recouverte de poly-D-lysine (plaque stérile ou lamelle). Préparez ces documents avant de remplir cette section.
- Après 15 h d’agitation, retirer le surnageant des fioles et de la plaque sur une boîte de Pétri stérile de 100 mm.
- Incuber le surnageant à 37 °C, 5 % CO2 pendant 30 min, en remuant après 15 min pour éliminer les microglies restantes, car celles-ci adhéreront très rapidement au plat. Des boîtes de Pétri non traitées par culture tissulaire peuvent être utilisées pour cette étape.
- Retirer le surnageant cellulaire non adhérent, compter et déposer une plaque sur une surface recouverte de poly-D-lysine. En règle générale, 7 500 à 10 000 OPC sont plaqués/cm2.
- Incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant au moins 1 h (jusqu’à 6 h), puis aspirer doucement 95 % du milieu et ajouter lentement le milieu OPC chaud, en le poussant contre la paroi du puits pour minimiser la perturbation des OPC. Changez de support toutes les 48 h jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à l’emploi.
REMARQUE : Il est essentiel qu’un seul puits soit changé à la fois. Les OPC sont sensibles et sont particulièrement intolérants aux conditions sèches. L’ajout de PDGF-AA dans les milieux OPC a pour but de retarder la maturation des OPC en oligodendrocytes. Ce facteur peut être exclu des milieux de culture si l’expérience porte sur les oligodendrocytes matures.
Tableau 1 : Recettes de tampon et de média.
Média gliale mixte (MGM)
| 88 ml | 1X DMEM (hyperglucose, avec L-glutamine, avec pyruvate de Na) |
| 10 ml | FBS inactivé par la chaleur |
| 1,0 mL | L-Glutamine (100X) |
| 1,0 mL | Antibiotique/antimycosique |
Média OPC (50mL)
| 49 ml | Milieux neurobasaux |
| 1,0 mL | Supplément B27 (50X) |
| 10 ng/ml | PDGF-AA |
| REMARQUE : PDGF-AA est ajouté avant chaque changement de support. |