Une technique pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Résumé

Source : Boisvert, E. M., et al. A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp (2020).

Cette vidéo présente une technique de génération d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). La culture adhérente des colonies de CSEh est traitée avec des enzymes pour les détacher et les briser en grappes. Ces amas forment des sphères tridimensionnelles en suspension, qui sont ensuite amenées à se différencier en organoïdes qui imitent le cortex cérébral avec des couches de neurones et de cellules gliales.

Protocole

1. Maintenance des cellules souches

1. Maintenir les CSEh H9 sur une couche de matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit (voir le Tableau des matériaux, ci-après simplement appelée matrice) selon les instructions du fabricant.
   1. Pour enrober une assiette à 6 puits ou un plat de 10 cm, combinez 100 μL de matrice avec 5,9 ml de milieu Eagle modifié Dulbecco/F12 glacé. Enveloppez les plaques dans un film de paraffine et conservez-les toute la nuit à 4 °C. Utilisez-les le lendemain pour le passage des cellules après l’aspiration de l’excès de matrice/média.
2. Cultivez les cellules d’une semaine à l’autre à un rapport de division d’environ 1:12 tous les 7 jours. Maintenir les cellules à l’aide d’un milieu mTESR-1 dans un incubateur à 37 °C et à faible teneur en oxygène (5 % O₂, 5 % CO₂). Actualisez les médias tous les jours. Éliminez les cellules différenciatrices de la culture entre les passages à l’aide d’outils en verre.
3. Les cellules H9 doivent être passées quatre à six jours avant de les utiliser pour produire des organoïdes. Les cellules doivent être traversées selon un rapport d’environ 1:8 des amas de cellules. Pour ce faire, commencez par rincer les cellules avec le milieu modifié Eagle de Dulbecco et le mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12) et dissociez les cellules avec une protéase neutre (par exemple, dispase, ci-après simplement appelée protéase), rincez avec du DMEM/F-12 et plaquez en 30 à 60 amas de cellules sur 4 plaques (6 puits ou 10 cm) à ~20 % de confluence. Deux jours avant la récolte, transférez-les dans un incubateur régulier (21 % O₂, 5 % CO₂). Les plaques doivent atteindre ~80 % de confluence au début de la formation d’organoïdes.

2. Dissociation des CSEh pour la culture organoïde

1. Aliquote de la solution mère de protéase (5 U/mL).
   note: Nous congelons généralement des aliquotes de 1 mL à -20 °C pour une utilisation sur plusieurs mois.
2. Diluer la solution mère de protéase à la concentration de travail en ajoutant 1 mL de la solution mère plus 5 mL de DMEM/F12 pour chaque plaque de 6 puits ou 10 cm de CSEh.
3. Aspirez et retirez le milieu de culture cellulaire, puis recouvrez les CSEh avec la solution de protéase. Placez les plaques dans l’incubateur pendant 10 à 15 minutes ou jusqu’à ce que les bords des colonies s’arrondissent et commencent à se séparer de la matrice.
4. Inclinez la plaque, aspirez la solution de protéase et lavez doucement les cellules avec DMEM/F12 trois fois. Utilisez 2 ml/puits pour chaque lavage si vous utilisez une plaque à 6 puits et 6 ml si vous utilisez une plaque de 10 cm. Assurez-vous que les colonies restent attachées à la matrice lorsque vous effectuez cette étape.
5. Rajoutez environ 1,5 mL de milieu mTESR frais dans chaque puits (ou 5 mL pour une plaque de 10 cm) et rincez les cellules de la plaque à l’aide d’un pipetage doux.
6. À l’aide d’une pipette de 10 ml, aspirez doucement et distribuez des CSEh dans la plaque jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 1/30e de leur taille d’origine. Les grappes de colonies doivent ressembler à des carrés de ~250-350 μm à la fin de ces étapes.

3. Génération d’organoïdes

1. Transférez les cellules dans une seule fiole T75 à très faible fixation contenant 30 mL de milieu mTESR sans facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF).
2. Le lendemain, inclinez le(s) flacon(s) de manière à ce que les cellules vivantes s’accumulent dans le coin (cela peut prendre 5 à 10 minutes le premier jour, mais cela s’accélérera à mesure que les grappes grossissent).
   note: S’il y a un grand nombre de cellules qui ont adhéré au fond du ballon à cette étape ou à toute étape ultérieure, transférez les cellules dans un nouveau ballon. Il est normal d’avoir une forte population de cellules mortes pendant les deux premiers jours. Lorsque vous effectuez des changements de support, assurez-vous d’enlever autant de débris cellulaires que possible.
3. Une fois que les cellules se sont déposées, aspirez les milieux et les cellules mortes, laissant environ 10 ml de milieu contenant les cellules vivantes.
4. Ajouter ~20 mL de milieu à faible teneur en bFGF (DMEM/F12 complété par 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamine, 1x acide aminé non essentiel (NEAA), 0,05 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,1 mM de monothioglycérol (MTG) complété par 30 ng/mL bFGF).
5. Vérifiez les cellules le jour 2. Si la plupart des cellules ont l’air saines et brillantes, il n’est pas nécessaire de faire quoi que ce soit. Cependant, si plus d’un tiers des cellules apparaissent foncées, remplacez le milieu (en utilisant la même technique d’inclinaison qu’à l’étape 3.2) par ~20 mL de milieu à faible bFGF complété par 20 ng/mL de bFGF.
6. Le jour 3, remplacer la moitié du milieu (en utilisant la technique d’inclinaison à l’étape 3.2) par 20 mL de milieu à faible teneur en bFGF complété par 10 ng/mL de bFGF.
7. Le 5e jour, remplacer la moitié du milieu (en utilisant la technique d’inclinaison à l’étape 3.2) par 20 ml de milieu d’induction neurale (NIM : DMEM/F12, 1x supplément de N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL d’héparine).
   note: S’il y a de grands amas de cellules ou d’organoïdes beaucoup plus grands que les autres, ils doivent être retirés de la culture. La taille est estimée par l’apparence au microscope ; Par exemple, à l’aide d’un oculaire avec réticule. La majorité des organoïdes sont de taille similaire (environ 100 ± 20 μm). Nous avons retiré des organoïdes qui étaient environ 2 fois plus petits ou plus grands que les autres.
8. Remplacez la moitié du fluide (~15 ml) (en utilisant la technique d’inclinaison) par NIM tous les deux jours.
9. Après 3 semaines de culture, ajouter 100 fois la pénicilline/streptomycine dans le milieu (NIM : DMEM/F12, 1 supplément de N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL d’héparine) à une concentration finale de 1 fois si désiré. Actualisez le média tous les deux jours.
   note: De cette façon, nous avons maintenu les organoïdes jusqu’à 6 mois en culture.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Supplément B27	Gibco, Waltham, MA, États-Unis	Référence 17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, Californie, États-Unis	PHG0263
Bsa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	N° A9647
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	Référence 7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	Référence 11330-032
Le	Gibco, Waltham, MA, États-Unis	10010023
Matrigel à facteur de croissance réduit (matrice)	Corning, Corning, État de New York, États-Unis	356231
H9 CSEh	WiCell, Madison, WI, États-Unis	WA09
héparine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	Référence 9041-08-01
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, États-Unis	Référence 25030-081
Monothioglycérol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	Référence M6145
Médias mTESR	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	Référence 85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, États-Unis	400 à 163
NEAA	Gibco, Waltham, MA, États-Unis	Référence 11140-050
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	T8787-100ML
Flacons T75 à fixation ultra-basse	Corning, Corning, État de New York, États-Unis	Référence 3814