1. Dissection du mésencéphale ventral et de la moelle épinière
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes, à l’exception des étapes 1.1.1−1.1.3 et 1.1.5−1.1.6 sous un stéréomicroscope à dissection de fluorescence. Le temps total de dissection par expérience est généralement de 3 à 5 h, en fonction de la maîtrise de la technique de dissection et du nombre de motoneurones requis pour chaque expérience.
- Dissection du mésencéphale ventral
- Euthanasier une souris enceinte environ 11,5 jours après la fécondation par le dioxyde de carbone et la luxation cervicale.
- Vaporisez abondamment l’abdomen avec de l’éthanol et retirez l’utérus à l’aide de ciseaux de micro-dissection stériles et d’une pince à pansement pour le pouce. Lavez brièvement l’utérus dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS), puis transférez-le dans la plaque de dissection remplie de PBS stérile pré-réfrigéré.
- Retirez soigneusement les embryons positifs à l’IslMN :GFP (Isl motor neuron : green fluorescent protein) de l’utérus à l’aide de ciseaux de micro-dissection stériles, d’une pince à pansement pour le pouce et d’une pince à épiler Dumont #5 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile glacée sous la lumière vive du microscope. À l’aide d’une mini-cuillère perforée Moria stérile, transférez chaque embryon dans un puits séparé d’une plaque de 24 puits remplie d’un milieu à faible fluorescence Hibernate-E pré-refroidi complété par 1x B27. Gardez la plaque à 24 puits sur de la glace.
- Transférez un embryon dans une plaque de dissection stérile et couvrez-le complètement avec une solution saline équilibrée de Hank's stérile et glacée (HBSS).
- Assurez-vous que les étapes de dissection sont effectuées sous l’éclairage de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) du microscope. À l’aide d’une pince à épiler, retirez la queue et le visage de l’embryon sans endommager le mésencéphale (Figure 1Ba). Placez l’embryon couché, les membres chevauchés en dessous et la queue pointant vers l’avant du microscope, vers le dissecteur (indiqué par un astérisque, Figure 1Bb).
- À l’aide d’une pince à épiler, fendez le toit du quatrième ventricule afin de générer une petite ouverture. Utilisez cette ouverture pour accrocher une pince à épiler dans l’espace créé entre le quatrième ventricule et son toit. Disséquer le long de la surface dorsale de l’embryon rostral jusqu’au cortex et latéralement à la plaque de plancher et à la colonne motrice (Figure 1Ca,b). Ouvrez le tissu disséqué à livre ouvert pour révéler les noyaux de neurones oculomoteurs (nerf crânien 3 [CN3]) et de neurone trochléaire (nerf crânien 4 [CN4]) positifs à la GFP><.
REMARQUE : Un petit morceau de tissu du mésencéphale ventral contenant le mésenchyme, le CN3 et le CN4 sera maintenant exposé.
- Séparez soigneusement le mésencéphale ventral de l’embryon et retirez le tissu méningé à l’aide d’une pince à épiler et d’un micro-couteau de dissection. Disséquez les noyaux bilatéraux de CN3 et de CN4 à GFP positive en les éloignant de la plaque de sol et d’autres tissus environnants à GFP négative à l’aide d’une pince à épiler et d’un microcouteau de dissection (figure 1D). Maximisez le nombre de motoneurones positifs à la GFP dans le tissu excisé, mais évitez de les toucher ou de les endommager.
- Si l’on souhaite un ensemble de noyaux CN3 et CN4 séparés, coupez le long de la ligne médiane de ces deux noyaux (ligne pointillée jaune sur la figure 1D). À l’aide d’une pipette P1000, prélevez le tissu du mésencéphale ventral disséqué avec un HBSS minimal et placez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,7 ml rempli de milieu de dissection. Conserver sur glace jusqu’à dissociation.
- Continuez à regrouper les mésencéphales ventrales d’embryons supplémentaires dans le même tube jusqu’à ce que le nombre total réponde aux exigences expérimentales (reportez-vous à l’étape 4 pour le nombre idéal de cellules
REMARQUE : Une collection groupée d’au moins 10 mésencéphales ventraux produisant environ 1 x 104 motoneurones CN3/CN4 est recommandée car les tissus sont soumis à un stress pendant la dissociation et le tri.
- Dissection de la moelle épinière ventrale
- Maintenez l’embryon couché avec la tête tournée vers l’avant du microscope, vers le dissecteur. Tenez l’embryon avec une pince à épiler et insérez l’extrémité de l’autre paire de pinces dans la partie caudale non ouverte du quatrième ventricule.
- Ouvrez le reste du cerveau postérieur et de la moelle épinière dorsalement sur toute l’étendue rostrocaudale de l’embryon. Ouvrir en coupant le tissu dorsal, en commençant par le quatrième ventricule et en allant vers le canal central de la moelle épinière caudale à l’aide de la pince comme ciseaux (Figure 1Ca,b). Veillez à ne pas toucher ou endommager la moelle épinière ventrale pendant cette procédure.
- Tenez l’embryon à l’aide d’une pince à épiler et pincez le rabat du tissu dorsal de chaque côté avec l’autre paire de pinces (Figure 1Ea,b).
REMARQUE : Les tissus dorsaux excisés contiennent la peau dorsale, le mésenchyme, les ganglions de la racine dorsale (DRG), le cerveau postérieur dorsal et la moelle épinière. Retirez autant de ces tissus que possible sans endommager les noyaux des motoneurones spinaux (SMN), car ils sont adhésifs et peuvent piéger les SMN pendant le filtrage ou provoquer un colmatage lors du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
- Retirez la moelle épinière ventrale à l’aide du couteau de microdissection pour percer directement sous le NMS positif à la GFP. Soulevez la moelle épinière ventrale avec des mouvements en forme de scie des deux côtés (Figure 1Fa,b). Coupez la moelle épinière ventrale flottante transversalement directement au-dessus de C1, là où la première corne antérieure positive à la GFP se projette (Figure 1G). Coupez également transversalement à la limite supérieure du membre inférieur (Figure 1G). Retirez la partie cervicale-lombaire (C1)-L3) de la moelle épinière ventrale après cette procédure.
- Placez la moelle épinière ventrale, côté dorsal vers le haut, et maintenez en pressant le tissu GFP-négatif entre les colonnes SMN GFP positives avec une pince à épiler. Retirez le mésenchyme attaché, les DRG et la moelle épinière dorsale restants en coupant les deux côtés de la colonne SMN GFP positive à l’aide du couteau de microdissection (Figure 1H). Prenez soin de maximiser les motoneurones positifs à la GFP sans les endommager.
- À l’aide d’une pipette P1000, prélever le tissu de la moelle épinière ventrale disséqué avec un HBSS minimal et le placer dans le tube de microcentrifugation de 1,7 mL marqué SMN rempli de milieu de dissection. Conserver sur glace jusqu’à dissociation. Continuer à regrouper les moelles épinières ventrales d’embryons supplémentaires dans le même tube jusqu’à ce que le nombre total réponde aux exigences expérimentales.
note: Il est recommandé de prélever au moins trois moelles épinières ventrales, ce qui donne environ 2,1 x 104 SMN, car les tissus sont soumis à un stress lors de la dissociation et du tri.
- Collectez les motoneurones faciaux et les extrémités des embryons de souris IslMN :GFP en tant que témoins GFP positifs et GFP négatifs pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), respectivement. Les extrémités sont GFP négatives parce que les axones GFP positifs des SMN ne se sont pas encore étendus dans les extrémités à cet âge embryonnaire.
2. Dissociation tissulaire
REMARQUE : Le temps total de dissociation est généralement de 1,5 h par expérience.
- La solution chaude de papaïne et d’inhibiteur de l’albumine-ovomucoïde aliquote à 37 °C 30 min avant la dissociation.
- Faites tourner brièvement des tissus micro disséqués à basse vitesse.
- À l’aide d’une pipette P100, prélevez soigneusement la plus grande quantité possible d’Hibernate E sans aspirer de tissus.
REMARQUE : Assurez-vous d’éliminer tous les résidus d’Hibernate E après cette étape pour éviter de réduire l’efficacité de la dissociation de la papaïne à l’étape suivante.
- Ajouter le volume approprié de solution de papaïne (tableau 1) dans chacun des tubes de microcentrifugation de 1,7 mL contenant les échantillons de tissus microdisséqués.
REMARQUE : Le volume approprié de papaïne pour la dissociation a été déterminé afin de maximiser la dissociation efficace tout en minimisant le stress sur les cellules.
- Triturez doucement 8x avec une pipette P200. Effectuez toutes les étapes de trituration en douceur pour préserver la viabilité des motoneurones.
- Incuber les tubes contenant les tissus pendant 30 min à 37 °C, en agitant 10 fois toutes les 10 minutes en effleurant les doigts. Triturer doucement chaque suspension 8 fois avec une pipette P200 après l’incubation. Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min.
- Pour garantir l’efficacité de l’inhibition ovomucoïde à l’étape suivante, utilisez une pipette P1000 pour retirer et jeter autant de surnageant que possible sans aspirer les tissus.
- Remettre les pastilles en suspension dans le volume approprié de solution d’inhibiteur d’albumine-ovomucoïde (tableau 1) en triturant doucement 8x avec une pipette P200.
- Attendez 2 minutes pour permettre aux morceaux de tissu non dissociés restants de se déposer au fond du tube.
- Prélever autant de surnageant que possible sans aspirer de tissus non dissociés à l’aide d’une pipette P200. Transférez le surnageant dans des tubes de microcentrifugation frais de 1,7 ml.
- Si certains morceaux de tissu restent non dissociés après l’étape 2.10, répétez les étapes 2.8 à 2.10 pour les tissus non dissociés qui restent dans les tubes de microcentrifugation d’origine de 1,7 mL afin de maximiser le rendement final des cellules dissociées tout en minimisant le stress sur les cellules dissociées précédemment, contenues dans le surnageant de l’étape 2.10.
- Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min. Retirez et jetez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette P1000.
- Remettre la pastille en suspension dans le volume approprié de milieu de dissection (tableau 1) en pipetant 8x à l’aide d’une pipette P1000. Le volume approprié de suspension finale a été déterminé de manière à ce que la densité cellulaire ne dépasse pas 107 cellules/mL, ce qui peut bloquer le flux de la machine de cytométrie en flux, mais aussi pour que les cellules ne soient pas excessivement diluées, ce qui entraîne un ralentissement de la vitesse de tri.
- Filtrez les suspensions à travers des crépines de 70 μm pour éliminer les gros amas ou les tissus non digérés. Transférez les suspensions dans des tubes à essai en polystyrène à fond rond de 5 ml et rangez-les sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
3. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
REMARQUE : Ce protocole a été optimisé à l’aide d’un trieur FACS équipé d’un laser violet de 15 mw 405 nm, d’un laser bleu de 100 mw 488 nm, d’un laser orange de 75 mw 594 nm et d’un laser rouge de 40 mw 640 nm. Les cellules ont été triées sous forme de fluide de gaine dans du PBS stérile dans des conditions aseptiques à l’aide d’une buse de 100 μm. Afin de minimiser le stress cellulaire, le débit a été réglé à une pression d’échantillon de 1−3, de sorte qu’un maximum de 1 000−4 000 événements par seconde ont été acquis. Le temps total de FACS est généralement de 1 à 2 h par expérience.
- Configurez les tensions pour la diffusion directe et latérale afin que la population cellulaire puisse être visualisée correctement. La mise en place de tensions appropriées pour le tri des cellules est complexe et nécessite un opérateur FACS expérimenté.
- Pour distinguer différentes populations de cellules, tracez les cellules en fonction de leur taille, déterminée par la zone de diffusion directe (FSC-A), par rapport à la complexité interne, déterminée par la zone de diffusion latérale (SSC-A). Tracez une porte autour des cellules vivantes comme indiqué sur les figures 2Aa et Ba pour exclure les débris et les cellules mortes. Regroupez les cellules de la région contrôlée en tant que population 1 (P1).
- Pour exclure les amas et les doublets de cellules, tracez ensuite les cellules P1 en fonction de la largeur de diffusion latérale (SSC-W) par rapport à la SSC-A. Porte la population de cellules uniques en tant que population 2 (P2) (Figure 2Ab et Figure Bb).
- Tracez les cellules P2 en fonction de la largeur de diffusion vers l’avant (FSC-W) en fonction de la FSC-A et fixez la population de cellules uniques en tant que population 3 (P3) (Figure 2Ac et Figure Bc).
note: L’utilisation de deux portes consécutives dans les sections 3.3 et 3.4 exclut les amas de cellules et les doublets (FSC-W élevée et FSC-A élevée).
- Cellules Gate P3 basées sur la GFP par rapport à l’allophycocyanine (APC). Le canal APC détecte l’autofluorescence. Le gate sur ce canal évite de capturer des cellules autofluorescentes. Utilisez des cellules GFP négatives pour ajuster la tension des canaux fluorescents FITC/GFP. Idéalement, positionnez les portes pour ces populations cellulaires autour de 102. Sélectionnez les seuils de porte pour la population 4 positive à la GFP 4 (P4) individuellement pour chaque type de motoneurone (Figure 2Ad et Figure Bd).
REMARQUE : Réglez la porte GFP beaucoup plus haut pour les SMN que pour les CN3/CN4 afin d’obtenir une culture pure (Figure 2Ad et Figure Bd). Une porte GFP plus basse pour les cultures SMN conduit à la contamination des cultures par les neurones gliaux et non moteurs. Cela est probablement dû au fait qu’il y a une faible expression de la GFP dans certains neurones gliaux et non moteurs en raison d’un promoteur qui fuit. Le pourcentage de cellules GFP positives par rapport aux cellules totales est généralement de 0,5 à 1,5 % pour les CN3 et les CN4 et de 1,5 à 2,5 % pour les NMS. Si la dissection a réussi, ces chiffres peuvent être utilisés comme référence pour déterminer la position appropriée pour la porte GFP positive (Figure 2Ae et Figure Be).
- Effectuez le FACS selon le protocole du fabricant. Recueillir les cellules P4 dans des tubes de microcentrifugation frais de 1,7 mL remplis de 500 μL de milieu de culture de motoneurones. Conserver sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit dressé.
note: Bien que les cellules puissent être triées directement dans les puits, il en résulte un nombre impair de cellules par puits. Triez les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,75 ml, puis plaquez-les manuellement afin d’obtenir une distribution plus uniforme du placage.
4. Culture de motoneurones primaires purifiés
- Diluer des suspensions de CN3/CN4 et de SMN isolées par FACS avec un milieu de culture de motoneurones préchauffé à 37 °C à des densités de 5 x 103 et 1 x 104 cellules/mL, respectivement.
note: Un embryon E11.5 produit environ 1 x 103 CN3/CN4 et 7 x 103 SMN. Cependant, ces rendements dépendent fortement de la pureté des tissus disséqués, de la minutie de la dissociation cellulaire et du seuillage approprié des portes GFP pendant la FACS.
- Transférez des plaques de 96 puits pré-enduites de poly D-lysine (PDL) et de laminine de l’incubateur de culture tissulaire à 37 °C vers le capot à flux laminaire et aspirez la laminine de chaque puits. Utilisez les plaques et les lamelles immédiatement sans les laver.
- Ajouter 200 μL de suspensions diluées de CN3/CN4 et de SMN dans chaque puits de plaques à 96 puits recouvertes de PDL/laminine. Les densités cellulaires finales doivent être de 1 x 103 et de 2 x 103 cellules/puits pour CN3/CN4 et SMN, respectivement.
note: La densité initiale de placage des SMN dans les plaques de 96 puits (2 x 103 cellules/puits) est le double de celle des CN3/CN4 (1 x 103 cellules/puits) afin d’obtenir des nombres et des densités finaux de motoneurones similaires à 2 et 9 jours in vitro (DIV) (4−6 x 102 et 2−4 x 102 cellules par puits, respectivement).
- Cultivez des neurones dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2.
- Nourrissez les neurones tous les 5 jours en retirant la moitié de l’ancien milieu (100 μL) et en le remplaçant par le même volume de milieu de culture de motoneurones frais. S’assurer que les processus neuronaux deviennent visibles sur 1 DIV et deviennent plus épais et plus longs sur 14 DIV (Figure 3). Les corps cellulaires neuronaux grossissent et ont tendance à s’agréger dans les cultures à long terme, en particulier pour les NMS (Figure 3).
REMARQUE : Effectuez toutes les modifications du milieu et de la solution en laissant la moitié du volume du milieu d’origine afin d’éviter de détacher les cellules cultivées. Cela inclut les étapes de fixation et d’immunocytochimie (ICC). Si tous les supports sont retirés, peu importe à quel point ils sont doux, la plupart des cellules se détacheront et seront emportées.
