1. Configuration initiale
- Réglage des concentrations de gaz et de température
- À l’aide du logiciel, cliquez sur l’onglet « Invité » dans le coin supérieur gauche de l’interface graphique. Connectez-vous au système à l’aide d’un nom d’utilisateur et d’un mot de passe désignés. Assurez-vous que chaque utilisateur dispose de son nom d’utilisateur et de son mot de passe.
- Cliquez sur un module pour l’ajuster (Figure 1). Dans la nouvelle fenêtre affichant les paramètres actuels, cliquez sur la valeur de consigne O2 existante sous « Point de consigne » et entrez le niveau de concentration O2 requis pour ce module. Entrez 5 % O2 si des cellules souches pluripotentes seront cultivées ou manipulées dans ce module et 9 % O2 si des cellules souches neurales seront cultivées ou manipulées. Cliquez sur la coche verte pour confirmer le point de consigne.
note: Deux modules ne sont pas réglables en gaz : le pare-soleil laminaire et la chambre de microscope. Les concentrations de gaz dans la hotte à flux laminaire sont atmosphériques, tandis que celles dans la chambre de traitement maintiennent passivement celles dans la chambre du microscope.
- Répétez cette étape pour le CO2. Entrez un point de consigne de 5 % de CO2 pour tous les modules, à l’exception des chambres tampons, qui ne s’ajustent qu’à O2.
- Surveillez les concentrations de gaz actuelles étiquetées « valeurs de processus » pour vous assurer qu’elles atteignent les nouveaux points de consigne.
- Ajustez les points de consigne de gaz de tous les modules aux valeurs appropriées. Faites correspondre les niveaux de CO2 et O2 des chambres qui seront exposées l’une à l’autre. Par exemple, ajustez la chambre de traitement à 5 %d’O2 avant d’ouvrir un incubateur qui fait pousser des cellules à 5 % d’O2. Passez également à 5 % d’O2 dans toute chambre tampon utilisée pour ajouter des articles à la chambre de traitement pendant cette période.
- Réglez la température de la chambre de traitement à 37 °C à l’aide du même écran pour le réglage du gaz. De plus, la température du sol de la chambre de traitement doit être réglée à 37 °C.
- Cliquez sur les banques de modules d’incubation sous chaque incubateur. Ajustez la température des berges à 37 °C.
- Fonctionnement des chambres tampons
- Rassemblez toutes les fournitures nécessaires à la tâche donnée (alimentation, fendage, coloration, etc.) dès le début afin d’éviter un retard dans le flux de travail. Vaporisez généreusement tous les matériaux avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher dans le capot laminaire. Ne vaporisez pas de flacons ou de plaques de cellules, essuyez-les délicatement avec une éponge de gaze stérile saturée de 70 % d’éthanol.
- Assurez-vous que les portes extérieure et intérieure de la chambre tampon sont bien fermées. Ensuite, ouvrez la porte extérieure et placez les articles à l’intérieur.
- Fermez la porte extérieure. Sélectionnez le module tampon dans le logiciel et cliquez sur l’onglet Facteur de dilution. Entrez-en un dans la zone du facteur de logarithme. Cliquez sur start.
Remarque : Un « facteur de dilution » signifie que l'atmosphère du module tampon sera évacuée et remplacée une fois par un gaz propre filtré HEPA.
- Une fois que l'interface graphique cesse de clignoter « facteur de dilution », ouvrez la porte intérieure de la chambre tampon et amenez les matériaux à l'intérieur de la chambre de traitement.
Attention : Ne laissez pas les portes intérieure et extérieure s’ouvrir simultanément et n’ouvrez pas la porte intérieure si la chambre tampon n’a pas subi de facteur de dilution.
- Tout d’abord, retirez les éléments de la chambre de traitement et assurez-vous que la chambre tampon a subi un facteur de dilution. Ensuite, ouvrez la porte intérieure, placez les objets à retirer à l’intérieur et fermez la porte intérieure. Ensuite, ouvrez la porte extérieure et retirez les articles.
Remarque : Un facteur de dilution ne doit pas être appliqué avant d’ouvrir la porte extérieure.
2. Introduire et nourrir les cellules
- Configuration de l’incubateur
- Placez 3 boîtes de Pétri dans le bac à eau à la base de chaque incubateur. Remplissez ces plats avec de l’eau stérile, sans remplir directement la casserole. Maintenez le niveau d'eau dans ces plats, car ils sont essentiels au maintien du point de consigne de l'humidité relative (HR) des incubateurs.
- Dans l’interface graphique, cliquez sur l’incubateur. Sous le point de consigne, cliquez sur la valeur d’humidité relative (HR) existante et entrez 85 %. Cliquez sur la coche verte pour accepter cette valeur.
- Préparation de l’installation de production de cellules pour les cellules
- Si ce n’est pas déjà fait, ajustez les chambres tampons, la chambre de traitement et un incubateur aux points de consigne de gaz requis pour le type de cellule introduite.
- Nettoyez la surface de la chambre de traitement avec de la gaze stérile et un désinfectant ininflammable. N’utilisez pas de désinfectant à base d’acide peracétique ; Dans un système fermé, les vapeurs fortes et persistantes sont toxiques pour les cellules de mammifères. Utilisez plutôt des produits à base de chlorure de benzalkonium.
- Continuez à désinfecter. Nettoyez les gants et les surfaces fréquemment touchées, telles que les poignées de porte. Utilisez le désinfectant à fond mais avec parcimonie, car l’excès de liquide dans la chambre de traitement contribuera à l’humidité, à la condensation et à une éventuelle croissance microbienne.
- Nettoyez la surface de la hotte à flux laminaire et de la chambre tampon avec de l’éthanol à 70 % et laissez-la sécher. Placez le ballon ou la plaque de cellules (dans notre cas, les CSP (cellules souches pluripotentes) ou les CSN (cellules souches neurales)) dans la hotte et essuyez brièvement sa surface extérieure avec une éponge de gaze stérile imbibée d’éthanol.
- Placez le ballon ou la plaque dans la chambre tampon et analysez un facteur de dilution (étape 1.2.3).
- Une fois le facteur de dilution terminé, déplacez immédiatement le ballon ou la plaque dans l’incubateur approprié. Comme les incubateurs se trouvent à l’arrière de la chambre de traitement, tirez une étagère dans la chambre de traitement pour le placement des cellules. Évitez d'ouvrir les portes de l'incubateur inutilement ou pendant de longues périodes, car l'air de la chambre de traitement est très sec par rapport à celui des incubateurs et entraînera une perte d'humidité importante dans l'incubateur.
- Alimentation des cultures cellulaires
- Rassemblez les composants du milieu, tels que des pipettes sérologiques, une pipette électronique, de la gaze et un désinfectant. Rassemblez également un récipient à déchets pour le milieu de culture cellulaire épuisé, mais ne le remplissez pas d’eau de Javel. Amener les matériaux dans la chambre de traitement à travers une chambre tampon décrite à la section 1.2. Disposez les matériaux de manière à permettre un espace de travail optimal. Évitez de placer les articles non utilisés au centre de la chambre de traitement.
- Laissez le récipient du support légèrement ouvert pour permettre au fluide de s’équilibrer avec les niveaux de CO2 et d’O2 présents dans le système. Certains fabricants de fluides PSC indiquent de ne pas réchauffer les supports à 37 ºC ; Si c’est le cas, utilisez une chambre tampon pour équilibrer le fluide. Laisser le milieu s’équilibrer pendant 20 min.
- Retirez l’ancien milieu des puits à l’aide d’une pipette stéréologique appropriée et d’un pipetteur électronique. Pour les CSP, retirez toute la quantité restante de l’ancien milieu, sauf une petite quantité, pour éviter la dessiccation pendant le processus d’alimentation. Pour les NSC, retirez la moitié de l’ancien support. Pipetez les déchets dans le conteneur à déchets.
- Replacez la pipette usagée dans son emballage d’origine et déplacez-la sur le côté de la chambre de traitement ou dans une chambre tampon destinée à l’évacuation des déchets. À l’aide d’une pipette sérologique stérile fraîche, ajoutez du milieu frais dans des plaques de culture cellulaire et replacez les plaques dans l’incubateur désigné.
- À la fin de l’alimentation, vaporisez de la gaze avec un désinfectant et nettoyez soigneusement le sol et les poignées de porte de la chambre de traitement. Si plusieurs lignées cellulaires sont cultivées dans le système, stérilisez-les entre les repas de chaque lignée cellulaire. Cela permet de minimiser le risque de contamination croisée.
- Retirez les déchets ou autres objets inutiles à travers l’une des chambres tampons une fois terminé.
3. Séparation des cultures cellulaires
- Passage enzymatique de PSC ou de NSC
- Rassemblez tous les articles nécessaires au passage. Il s'agit notamment de milieux, d'enzymes ou de tampons de dissociation cellulaire non enzymatiques (ce dernier est réservé aux NSC), de DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline), de plaques ou de flacons, de matrice extracellulaire (ECM), de tubes coniques et de pipettes sérologiques. Apportez-les dans le système à l’aide d’une chambre tampon
.
- Enduire des assiettes ou des flacons frais avec de l’ECM, comme décrit précédemment 9,10. Certaines ECM, telles que celles dérivées de lignées cellulaires de sarcome de souris, ne sont liquides qu’entre 4 et 15 °C, utilisez donc un bloc froid stérilisé ou un bloc de glace en gel pour garder l’ECM froide pendant que vous travaillez dans la chambre de traitement chauffée.
- Retirez le milieu usagé de la culture et jetez-le dans le conteneur à déchets.
- Rincer le puits ou la surface du ballon à l’aide de 1 ml de DPBS/well et éliminer le DPBS.
- Ajoutez 1 à 2 ml d’enzyme chaude dans chaque puits. Seules les cultures très denses nécessitent 2 ml.
- Déplacez immédiatement la boîte de culture ou le flacon dans la chambre du microscope et observez la culture. Surveillez les signes que des cellules individuelles commencent à se détacher de la boîte. N’attendez pas que les cellules flottent en suspension avant de passer à l’étape suivante.
- Remettez les cellules dans la chambre de traitement principale. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml, ajoutez 4 ml de DPBS pour 1 ml d’enzyme, puis pipetez avec force de haut en bas pour déloger les cellules de la surface du puits. Si vous passez plusieurs puits à l’intérieur d’une plaque à parois multiples, ajoutez le DPBS à chaque puits avant de déloger les cellules des puits individuels.
- Transférez l’enzyme et la suspension cellulaire PBS dans un tube conique de taille appropriée.
- S’il n’y a pas de centrifugeuse dans l’installation de production de cellules, fermez hermétiquement le tube conique, placez-le dans une chambre tampon et fermez la porte.
- Retirez le tube conique de la chambre tampon du côté de l’écoulement laminaire et faites tourner les cellules à 100 x g pendant 5 min à RT.
- Vaporisez le tube conique avec de l’éthanol à 70 % et amenez-le dans la chambre de traitement à l’aide d’une chambre tampon et d’un facteur de dilution.
- Piquez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 2 ml de milieu PSC ou NSC. En cas de passage des CSP, inclure l’inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (Rho) dans le milieu à une concentration de 10 μM.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et déterminez les puits ou les plaques nécessaires. Plaques PSC à 5 x 104 - 1 x 105 cellules/cm2. Divisez les NSC selon un rapport de 1:2.
Remarque : Les CSN s’agglutinent souvent et résistent au comptage précis dans un hémocytomètre.
- Si la cryoconservation des cellules est nécessaire, assurez-vous que toutes les alimentations et les fluides de congélation sont préparés et placés à l’intérieur de la chambre de traitement. Le DMSO (diméthylsulfoxyde) est très toxique pour les cellules à 37 ºC, il agit donc rapidement. Conservez le récipient de congélation à enveloppe isopropanol à RT dans la hotte à flux laminaire. Une fois les flacons de cryoconservation remplis et scellés, retirez-les immédiatement de la chambre de traitement en les faisant passer dans une chambre tampon.
- Passage manuel des PSC
- Confirmez que la culture doit être adoptée, comme décrit précédemment. Si c’est le cas, préparez des assiettes ou des flacons frais recouverts de matrice extracellulaire. Ensuite, changez complètement de support.
- Nettoyez la chambre du microscope avec de la gaze stérile imbibée d’une quantité éparse de désinfectant ininflammable - une trop grande quantité entraînera une buée excessive. Nettoyez uniquement les gants, le sol et la scène. Introduisez dans la chambre plusieurs pointes de pipette de 200 μl ou 1 000 μl emballées individuellement.
- Amenez la plaque de CSP dans la chambre du microscope, retirez le couvercle et placez-la face vers le bas sur le sol fraîchement nettoyé. Laisser le couvercle vers le haut expose le dessous directement aux courants d’air et à la contamination potentielle.
- Déroulez l’embout d’une pipette et, à l’aide du microscope pour visualiser la culture, séparez les colonies de bonne morphologie à l’aide de l’embout de la pipette.
Remarque : La pointe de la pipette peut être attachée à une pipette si l’utilisateur individuel trouve cela plus confortable.
- Remettez le couvercle sur la plaque et remettez la plaque dans la chambre de traitement.
- Retirez l’excédent d’ECM de la nouvelle plaque et transférez le média de l’ancienne plaque (contenant les morceaux de colonie en suspension) sur la nouvelle plaque. Si l’ancienne assiette contient encore des colonies qui ne sont pas prêtes à être cueillies, nourrissez-les également.
