Purification de cellules précurseurs endothéliales CD31+ à l’aide du tri cellulaire activé par magnétisme

Résumé

Source : Matsuo, K., et al. Différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules de type cellule endothéliale microvasculaire cérébrale avec un phénotype immunitaire mature. J. Vis. Exp. (2023).

Cette vidéo présente une technique de purification des cellules progénitrices endothéliales (CPE) CD31⁺ à partir d’une culture à l’aide du tri cellulaire activé magnétiquement (MACS). La suspension cellulaire est traitée avec un anticorps conjugué au fluorophore qui se lie à CD31 sur les EPC. La réalisation du marquage des EPC CD31⁺ implique l’ajout d’un complexe d’anticorps, qui se lie aux fluorophores, et d’une nanoparticule magnétique enrobée de polymère, qui se lie au complexe d’anticorps. Les cellules marquées sont ensuite purifiées à l’aide d’un champ magnétique, éliminant toutes les cellules CD31^-.

Protocole

La lignée de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC), HPS1006, a été fournie par le RIKEN BRC dans le cadre du projet national de bioressources du MEXT/ AMED, Japon.

1. Induction de la différenciation des hiPSC dans les cellules progénitrices endothéliales (EPC)

1. Plaques et réactifs revêtus d’une matrice extracellulaire (ECM)
   1. Préparez des plaques à 12 puits recouvertes d’une matrice de membrane basale en aliquotent 2,5 mg de gel matriciel dans des tubes à centrifuger de 50 mL pour un stockage à -20 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à 6 mois. Ajouter dans le tube 30 ml de mélange moyen/nutritif F-12 modifié Eagle's de Dulbecco's, qui a été conservé au réfrigérateur (4 °C). Mélangez doucement par pipetage jusqu’à ce que le gel soit dégelé, puis ajoutez 500 μL de la solution dans chaque puits de la plaque à 12 puits. Placez la plaque dans un incubateur (37 °C, 5 % CO₂) pendant au moins 1 h
      note: Le gel matriciel de la membrane basale est sensible à la température et doit être manipulé conformément aux instructions du fabricant pour l'aliquotage et le revêtement des plaques. La concentration de protéines de la matrice extracellulaire peut varier d’un lot à l’autre. Pour garantir l’exactitude, la concentration exacte doit être indiquée sur la feuille de certificat de qualité du lot spécifique, à l’aide du numéro de lot. Par exemple, si la concentration exacte est de 10,0 mg/mL, utilisez 250 μL de gel pour un total de 2,5 mg.
   2. Préparer la solution mère de l’inhibiteur de la rho-kinase (ROCK) en dissolvant l’inhibiteur de la ROCK dans de l’eau stérile à une concentration de 10 mM (tableau 1). Aliquote la solution mère dans des volumes de 100 à 200 μL et conserve-la à -20 °C pour éviter les cycles de gel-dégel.
   3. Préparez une solution mère de 100 mg/mL d’acide L-ascorbique en dissolvant 5 g d’acide L-ascorbique dans 50 mL d’eau stérile et conservez-la à -20 °C (tableau 1). Ajouter 6,25 mL de glutamine et 305 μL de solution mère d’acide L-ascorbique dans 500 mL de DMEM/F12 avancé pour obtenir un milieu LaSR (tableau 1). Conserver à une température de 2 à 8 °C jusqu’à 2 semaines.
   4. Préparez CHIR99021 solution en dissolvant CHIR99021 dans du diméthylsulfoxyde non dilué (DMSO) jusqu’à une concentration finale de 10 mM (tableau 1). Placez la solution dans des volumes de 100 à 200 μL pour éviter les cycles de congélation-décongélation et conservez-la à -20 °C jusqu’à 1 an. Conservez les aliquotes de travail de la solution mère à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   5. Préparez le milieu DMEM/F12-10 en ajoutant 50 mL de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur à 450 mL de DMEM/F12. Conservez le milieu à une température de 2 à 8 °C pendant 1 mois maximum (tableau 1).
   6. Préparez le tampon d'écoulement-1 en ajoutant 33,3 mL d'albumine sérique bovine (BSA) à 7,5 % à 467 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de Dulbecco (tableau 1). Conserver à une température de 2 à 8 °C jusqu’à 6 mois.
2. Ensemencement des hiPSC singularisés et expansion pour la différenciation EPC (Jour -3 à Jour -1)
   1. Commencer la différenciation lorsque les colonies de hiPSC dans une plaque à 6 puits ne montrent pas de différenciation spontanée et ont la densité appropriée pour le passage, généralement autour de 80 % de confluence (2,5-3,5 x 10⁶ cellules). Surveillez attentivement les cellules différenciées spontanément au microscope pour vous assurer que plusieurs passages sont nécessaires pour éliminer les cellules non différenciées. Reportez-vous à la remarque fournie ci-dessous à l’étape 1.4.15 pour plus d’informations concernant le milieu de culture cellulaire et la matrice extracellulaire.
   2. Aspirez le milieu et ajoutez 1 mL de réactif de dissociation dans les puits et incubez pendant 5 à 7 min à 37 °C. Dissociez et singularisez les cellules en pipetant doucement la solution de réactif de dissociation sur les surfaces des puits deux ou trois fois.
   3. Transférez les cellules détachées dans un tube de 15 mL contenant 4 mL de milieu d’entretien hiPSC et remettez les cellules en suspension à fond. Réserver une aliquote de 10 μL pour le comptage des cellules.
   4. Granulez les cellules en les centrifugant pendant 5 min à 200 x g à 20-25 °C. Comptez les cellules et calculez le volume requis pour obtenir une densité appropriée de hiPSC (75-400 x 10³ par puits) dans une plaque à 12 puits recouverte d’une matrice de membrane basale (étape 1.1.1).
   5. Aspirer la solution d’enrobage des puits et ajouter 1 mL de milieu hiPSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK dans chaque puits (dilution de 1:1 000). Après centrifugation, aspirer le surnageant et dissocier la pastille dans 1 mL de milieu hiPSC.
   6. Ajouter le volume requis de hiPSC, déterminé à l’étape 1.2.4, dans chaque puits de la plaque à 12 puits. Deux à quatre plaques de 12 puits peuvent suffire à différencier un clone de hiPSC. Reportez-vous à l’étape 1.2.4 pour déterminer le nombre de plaques nécessaires pour l’ensemencement des cellules.
   7. Placez la plaque dans un incubateur (37 °C, 5 % CO²). Répartissez uniformément les cellules en faisant glisser doucement la plaque d’avant en arrière, puis d’un côté à l’autre dans l’incubateur.
   8. Le lendemain (c.-à-d. le jour -2), remplacez le milieu par 2 ml de milieu d’entretien hiPSC dépourvu d’inhibiteur de ROCK. Le lendemain (jour -1), remplacez le milieu par 2 ml de milieu d’entretien hiPSC frais.
3. Induction d’EPC avec l’inhibiteur de la glycogène synthase kinase 3 (GSK-3) CHIR99021 (Jour 0 à Jour 5)
   1. Le jour 0, remplacer le milieu d’entretien hiPSC dans chaque puits par 2 mL de milieu LaSR contenant 8 μM de CHIR99021.
   2. Le jour 1, aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu LaSR frais contenant 8 μM de CHIR99021.
   3. Les jours 2, 3 et 4, remplacez le milieu par 2 mL de milieu LaSR frais sans CHIR99021.
4. Tri cellulaire activé magnétique (MACS) pour purifier les EPC CD31+ (Jour 5)
   1. Le jour 5, aspirez le milieu, puis ajoutez 1 mL de réactif de dissociation dans chaque puits, avant de laisser incuber pendant 6 à 8 min à 37 °C.
   2. Dissocier et singulariser les cellules à l’aide d’une micropipette et les passer à travers une crépine de 40 μm pour filtrer la suspension dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de milieu DMEM/F12-10. Filtrez la suspension cellulaire recueillie à partir de plus de deux plaques à 12 puits dans au moins deux tubes de 50 ml.
   3. Arrêtez la réaction de digestion en ajoutant du milieu DMEM/F12-10 (jusqu’à 50 ml). Pipeter soigneusement et réserver 10 μL pour le comptage des cellules. Granuler les cellules en centrifugeant pendant 5 min à 200 x g à 20-25 °C.
   4. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez 10 ml de milieu DMEM/F12-10 et transférez la suspension cellulaire dans des tubes frais de 15 ml. Granuler les cellules en centrifugeant pendant 5 min à 200 x g à 20-25 °C.
   5. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans le tampon d’écoulement-1 à une densité de 1,0 x 10⁷ cellules par 100 μL de tampon.
   6. Ajouter le réactif bloquant le récepteur Fc (FcR) dans un rapport de 1:100 et incuber pendant 5 minutes avant d’ajouter l’anticorps CD31 dilué à 1:200 marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Incuber la suspension pendant 30 min dans l’obscurité à 20-25 °C.
   7. Ajouter 10 mL de tampon d’écoulement-1, en réservant 10 μL de la suspension pour l’analyse par cytométrie en flux afin de déterminer la fraction de cellules CD31⁺ (figure 1).
   8. Granuler les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à 20-25 °C. Ensuite, retirer le surnageant et remettre en suspension à une densité de 1,0 x 10⁷ cellules par 100 μL de solution tampon d’écoulement-1. Ajouter le cocktail de sélection FITC (5 μL pour 100 μL de suspension cellulaire). Bien mélanger par pipetage et incuber à l’obscurité pendant 15 min à 20-25 °C.
   9. Ajouter 5 μL de nanoparticules magnétiques pour 100 μL de suspension cellulaire, bien pipeter et incuber dans l’obscurité pendant 10 min à 20-25 °C.
   10. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de cytométrie en flux de 5 mL et ajoutez le tampon d’écoulement-1 pour obtenir un volume total de 2,5 mL. Placez le tube de cytométrie en flux dans l’aimant pendant 5 min.
   11. Dans un mouvement continu, retournez l’aimant et décantez la suspension cellulaire contenant des cellules qui n’ont pas été marquées avec l’anticorps FITC-CD31. Maintenez l’aimant et le tube en position inversée pendant 2-3 s, puis retirez le liquide restant. Aspirez toutes les gouttelettes sur le bord du tube avant de remettre le tube en position verticale.
   12. Prélever le tube de cytométrie en flux de l’aimant et ajouter 2,5 mL de tampon d’écoulement-1 pour laver les cellules CD31⁺ restantes. Remettez les cellules en suspension en les pipetant doucement de haut en bas deux ou trois fois. Placez le tube d’écoulement dans l’aimant pendant 5 min.
   13. Répétez trois fois les étapes 1.4.11 à 1.4.12, puis l’étape 1.4.11 pour un total de quatre lavages.
   14. Retirez le tube d’écoulement de l’aimant et ajoutez la quantité indiquée d’un milieu approprié (par exemple, un milieu sans sérum endothélial humain [hECSR] pour la culture EC prolongée ou un milieu de congélation pour la congélation) dans le tube pour remettre en suspension les cellules CD31⁺ purifiées. Réserver deux aliquotes de 10 μL de la suspension, l’une pour le comptage des cellules et l’autre pour effectuer une analyse par cytométrie en flux afin d’évaluer la pureté des cellules CD31⁺ dans les échantillons post-MACS (Figure 1). Si un cytomètre en flux n’est pas disponible immédiatement, conserver l’aliquote à 4 °C jusqu’à l’analyse.
   15. Gelez les EPC CD31+ à ce stade.
       note: Les plaques à 12 puits revêtues de vitronectine et le milieu de maintenance hiPSC plus stable (mTeSR plus) peuvent être utilisés à la place des plaques revêtues de matrice de membrane basale et du milieu de maintenance hiPSC (mTeSR1). Pour préparer des plaques à 12 puits recouvertes de vitronectine, diluez la vitronectine avec un tampon de dilution jusqu’à une concentration finale de 10 μg/mL, puis transférez 500 μL de la solution diluée dans chaque puits des plaques à 12 puits. Laissez les plaques à 20-25 °C pendant au moins 1 h. La densité d’ensemencement des hiPSC singularisées est comparable à celle utilisée pour les plaques revêtues de matrice de membrane basale. La modification du milieu de culture ou de la composition de la matrice peut avoir un impact sur la prolifération et la différenciation spontanée des hiPSC, qui nécessitent généralement 1 à 2 semaines pour s’adapter aux nouvelles conditions de culture. Si le support de maintenance hiPSC plus stable est utilisé pour la maintenance hiPSC, ce support peut être utilisé pour la différenciation EPC à la place du support de maintenance hiPSC. Dans ce cas, le milieu d’entretien hiPSC, plus stable, doit être changé au jour -2 pour éliminer l’inhibiteur de ROCK, et le remplacement au jour -1 peut être sauté.

Résultats

Tableau 1 : Détails des réactifs spécifiques pour les dosages. Le nom et la quantité exacte d’ingrédients pour chaque réactif spécifique sont décrits.

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Réactif spécifique	ingrédient	volume
Acide acétique, solution à 0,5 mg/mL	acide acétique	119 μL

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre à seringue de 0,22 mm	Le	Référence 99722
Tube à centrifuger de 15 mL	Faucon	352196
Passoire à cellules Falcon de 40 μm	Faucon	Référence 352340
Tube à fond rond de 5 mL	Spl	Réf. 40005
Tube à centrifuger de 50 mL	Faucon	Référence 352070
Plaque à 96 puits, fond rond	Spl	Référence 34096
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-500ml
acide acétique	Sigma-Aldrich	695092
DMEM/F12 avancé	Technologies de la vie	Référence 12634
Microscope à fluorescence tout-en-un	Cléence	BZ-X810
Supplément de B-27 (503), sans sérum	Thermo Fischer Scientific	17504044
Albumine sérique bovine (BSA), 7,5 % en dPBS	Sigma-Aldrich	A8412
Tampon de dilution CellAdhere	Technologies STEMCELL	ST-07183
CHIR99021	Produits chimiques Selleck	S1263
Collagène IV du placenta humain	Sigma-Aldrich	Réf. C5533
Plaques de culture tissulaire Corning (12 puits)	Corning	Référence 3512
Plaques de culture tissulaire Corning (6 puits)	Corning	Référence 3506
Tube cryo 2.0 mL	Watson	1396-201S
Diméthylsulfoxyde (DMSO), stérile	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM (13), [+] 4,5 g/L de D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate	Thermo Fischer Scientific	Référence 31053-028
Dulbecco's (d) PBS (sans calcium, magnésium)	Thermo Fisher	14190250
Mélange de milieu et de nutriments modifié Eagle's F-12 de Dulbecco (DMEM-F12)	Thermo Fischer Scientific	11320074
Kit de sélection positive EasySepFITC II	Technologies STEMCELL	Référence 18558
EasySepMagnet	Technologies des cellules souches	18000
Solution d’acide éthylènediaminetétraacétique0,02 % dans le DPBS	sigma	E8008-100ML
Sérum fœtal bovin, qualifié	Thermo Fischer Scientific	10270106
Solution tampon HEPES	Thermo Fischer Scientific	Référence 15630-056
Milieu libre sérique endothélial humain (hESFM)	Thermo Fischer Scientific	Référence 11111-044
Facteur de croissance des fibroblastes humains 2 (FGF2)	Tocris	Référence 233-FB-500
Cellules souches pluripotentes humaines induites par iPS	Riken RBC	HPS1006
Sulfate de kanamycine (100x)	Thermo Fischer Scientific	Référence 15160-047
Acide L-ascorbique 2-phosphate sesquisel de magnésium hydrate	Sigma-Aldrich	A8960-5G
L-Glutamine 200 mM (1003)	Thermo Fischer Scientific	Référence 25030-024
Matrigel, facteur de croissance réduit	Corning	Référence 354230
MEM NEAA (1003)	Thermo Fischer Scientific	Référence 11140-035
Inhibiteur de ROCK Y-27632	Tocris	1254
RPMI moyen 1640 Base Tris	Sigma-Aldrich	Référence 93362
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100