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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation du milieu mère et récupération des cellules souches
- Préparez le milieu de culture (DFHGPS) en combinant les réactifs aux étapes 1.1.1.-1.1.5.
- Ajouter 210 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium à haute teneur en glucose et en L-glutamine (D). Conservez-le à 4 °C.
- Ajouter 70 ml de mélange nutritif F12 de Ham avec un supplément de L-glutamine (F). Conservez-le à 4 °C.
- Ajoutez 4,2 ml de tampon HEPES de 15 mM (H) et conservez-le à température ambiante.
- Ajouter 4,2 ml de solution de D-glucose à 10 % (G) et la conserver à température ambiante.
- Ajouter 2,88 ml de solution de pénicilline/streptomycine (PS). Aliquote la solution mère en aliquotes de 3 mL et conservez les aliquotes à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
note: La concentration finale de pénicilline dans le milieu sera de 100 unités/mL, et la concentration de streptomycine sera de 100 μg/mL. Ce milieu sera appelé DFHGPS pour le reste du protocole et doit être stocké à 4 °C pour une utilisation dans un délai de 1 à 2 semaines. Si nécessaire, le DFHGPS peut être augmenté proportionnellement.
- La veille de la récupération des cellules, enduire un flacon T75 de 5 mL de milieu conditionné obtenu à partir de cultures précédentes de la lignée cellulaire hNSC et le laisser dans un incubateur à 37 °C avec 8,5 % de dioxyde de carbone (CO2) pendant la nuit.
note: Si vous cultivez actuellement des CSNh, conservez le milieu dans lequel les cellules ont grandi lors d’un changement de milieu. Il s’agit d’un milieu conditionné car il a été « conditionné » par les cellules. Le fluide conditionné peut être conservé dans un tube à bouchon à vis et stocké à 4 °C pendant environ 7 jours. Contactez l’auteur correspondant pour recevoir les hNSC. Le milieu conditionné est préféré mais pas absolument obligatoire, en particulier au début de la culture des hNSC.
- Le jour de la récupération, réchauffez 20 ml de DFHGPS dans un tube à bouchon à vis de 50 ml dans un bain-marie à 37 °C pendant au moins 10 minutes et conservez-le dans le bain-marie jusqu’au moment de l’utiliser.
- Dans un tube à bouchon à vis séparé de 15 ml, réchauffez 10 ml de DFHGPS dans un bain-marie à 37 °C pendant au moins 10 min et maintenez-le dans le bain-marie jusqu’au moment de l’utiliser à l’étape 1.13.
- Récupérez un contenant de glace et tous les composants du fluide (tableau 1). Décongelez tous les composants du fluide sur la glace et laissez-les sur la glace pendant que vous vous préparez au changement de milieu.
- Obtenez 5 ml de produit moyen conditionné (conservé à 4 °C) et conservez-le dans un bain-marie à 37 °C jusqu’au moment de l’utilisation à l’étape 1.14. Voir la note après l’étape 1.2 s’il n’y a pas de milieu conditionné ou de culture actuelle de cellules souches neurales neurales fœtales humaines.
- Récupérez le tube à bouchon à vis de 50 ml de l’étape 1.3 et placez-le dans l’enceinte de sécurité biologique (ESB). Transvasez 10 ml de DFHGPS dans un nouveau tube à bouchon à vis de 15 ml, puis remettez le tube de 50 ml contenant les 10 ml restants dans le bain-marie à 37 °C.
- Obtenir un cryo-flacon de hNSC stocké dans de l’azote liquide. Voir la note après l’étape 1.2 s’il n’y a pas de culture actuelle de cellules souches neurales neurales fœtales.
note: Les cellules souches neurales humaines ont été dérivées à l’origine de cerveaux fœtaux humains mis au rebut12 et maintenues en culture sans modifications génétiques10. 5 × 106 cellules doivent être décongelées et plaquées sur une fiole T75. Chaque flacon cryogénique doit contenir 5 × 106 cellules ; Par conséquent, un flacon par flacon est nécessaire.
- Décongelez un flacon de cellules dans un bain-marie à 37 °C en retournant le flacon toutes les 10 s pendant environ 1 minute ou jusqu’à ce que la glace soit fondue et que le contenu du flacon soit complètement liquide. Ne plongez pas toute la fiole sous l’eau pour éviter une contamination potentielle.
- Dans l’ESB, utiliser une micropipette P1000 pour aspirer la solution cellulaire décongelée et l’ajouter goutte à goutte dans le tube de 15 mL de l’étape 1.7, contenant 10 mL de DFHGPS. Pour ajouter la solution cellulaire décongelée goutte à goutte, appuyez lentement sur le piston de sorte que seule une goutte ou deux soient libérées à la fois. Entre-temps, agitez le tube de 15 ml pour permettre un mélange rapide.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant en veillant à conserver la pastille de cellule.
- À l’étape 1.11, récupérez le tube de 50 ml contenant les 10 ml restants de l’étape 1.7. Après la centrifugation, remettre la pastille de cellule en suspension dans le DFHGPS de 10 mL et centrifuger à nouveau à 200 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Au cours de l’essorage final, préparer le nouveau milieu de croissance en suivant le tableau 1 pour ajouter des facteurs de croissance aux 10 mL de milieu DFHGPS de l’étape 1.4 (tableau 1) dans l’ESB. Laissez le nouveau milieu contenant les facteurs de croissance dans l’ESB jusqu’au moment de l’utiliser.
- Récupérez le ballon T75 de l’étape 1.2 et jetez le milieu conditionné qui enrobe le ballon par aspiration. Ensuite, ajoutez les 5 ml de milieu conditionné de l’étape 1.6. dans la fiole à l’aide d’une pipette sérologique. Attention à ne pas rayer le fond de la fiole.
- Récupérez le tube de cellules de la centrifugeuse et jetez le surnageant en l’aspirant, en laissant la pastille de cellule intacte.
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 10 mL de nouveau milieu à partir de l’étape 1.13 à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Ajoutez la suspension dans la fiole T75 enduite à partir de l’étape 1.14. Utilisez les 5 ml restants pour rincer le tube qui contenait la pastille de cellule, puis ajoutez également ces 5 ml dans le ballon.
- Secouez le ballon T75 d’avant en arrière 3 fois pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties sur le ballon. Assurez-vous que le capuchon de la fiole est desserré pour permettre à l’air de circuler. Au microscope optique, observez les cellules, prenez des notes et prenez des images si possible.
note: Les cellules doivent avoir l’air translucides et sphériques. Notez s’il y a des cellules qui semblent sombres, opaques ou qui ont des bordures asymétriques, car cela peut indiquer la mort cellulaire. Surveillez également toute contamination fongique ou bactérienne, comme le fait que le support devienne de couleur jaune.
- Placer le ballon de cellules dans un incubateur à 37 °C avec 8,5 % de CO2,
note: Utilisez 8,5 % au lieu de 5,0 % de CO2 pour maintenir le pH de ce milieu de culture sans sérum dans la plage de 7,1 à 7,4.
2. Changement moyen hNSC
REMARQUE : Changez de milieu tous les 3-4 jours.
- Allumez le BSC et nettoyez-le soigneusement avec de l’éthanol à 70 %. Observez les cellules au microscope optique.
note: Prenez des notes sur l’apparence des cellules et la taille des sphères. Trois jours après la guérison ou le passage, les cellules se regroupent et commencent à former des neurosphères non adhérentes.
prudence: Si les cellules adhèrent au fond du flacon, la culture devra être jetée car l’adhérence cellulaire augmentera la différenciation prématurée et les cellules seront incapables de maintenir un état soumissionnaire. S’il y a trop de cellules dans le flacon, les cellules peuvent former de grandes sphères (de plus de 2 mm de diamètre), auquel cas, les cellules au centre de la sphère commenceront à se différencier en raison du manque d’accès aux facteurs de croissance dans le milieu. Si des sphères de plus de 1 mm de diamètre sont observées, les cellules peuvent être traversées (étapes 3.1-3.22).
- Suivez les étapes 1.4 et 1.5 et préparez 10 ml de milieu frais (voir l’étape 1.13).
- Inclinez le ballon sur le côté, permettant aux sphères de couler au fond du ballon.
- Retirer 5 ml de milieu conditionné du haut du milieu mélangé à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml, en prenant soin de ne pas aspirer de neurosphères. Placez les 5 ml de média conditionné dans un tube propre de 15 ml.
- Retirer 5 mL supplémentaires de milieu conditionné de la fiole, en évitant de nouveau soigneusement les sphères, et placer les 5 mL dans le même tube de 15 mL.
- Ajouter 10 mL de nouveau milieu de l’étape 2.2 aux 5 mL restants de milieu conditionné et de cellules dans le ballon. Posez le ballon à plat et observez les cellules au microscope optique.
- S’il semble que des cellules ont été aspirées pendant la collecte du milieu conditionné, faites tourner le milieu conditionné à 100 x g pendant 5 min à température ambiante. Remettez en suspension les cellules qui s’accumulent au fond dans 1 mL du milieu conditionné, puis ajoutez-les dans la fiole de culture.
- Conservez les 10 ml de support conditionné non utilisés des étapes 2.5/2.6 à 4 °C dans un tube à bouchon à vis de 15 ml.
- Répétez les étapes 1.17/1.18.
3. Passage du hNSC
- Si vous élargissez les NSC dans un nouveau flacon, assurez-vous que tous les nouveaux flacons sont enrobés comme à l’étape 1.2.
- Nettoyez le BSC comme à l’étape 2.1 et effectuez les étapes 1.4 et 1.5.
- Préparez le milieu comme à l’étape 1.13. Chaque fiole T75 nécessite 10 mL de fluide. Pour plusieurs flacons T75, multiplier 10 mL de milieu par le nombre de flacons.
- Préparez 1 ou 3 ml de solution saline tamponnée au phosphate (dPBS) et de glucose de Dulbecco et placez-les dans un bain-marie à 37 °C pour les réchauffer pendant 10 minutes (pour une solution de trypsine) selon les volumes indiqués au tableau 2. N’ajoutez pas de trypsine ou de DNase pour le moment. La DNase peut être nécessaire pour décomposer l’ADN libéré par les cellules mortes en raison de la dissociation mécanique ou chimique des cellules.
REMARQUE : Pour un ballon T75 passé après 9 à 10 jours de croissance, il y aura environ 30 × 106 cellules si 5 × 106 ont été initialement ensemencées sur le ballon. En règle générale, 1 mL de solution dPBS est utilisé pour 10 × 106 cellules. Par conséquent, 3 mL de solution dPBS sont nécessaires pour un flacon T75 passé après 9-10 jours.
- Placez un petit bateau de pesée propre et un hémocytomètre dans la capuche. Nettoyez avec de l’éthanol à 70 % et laissez sécher à l’air libre dans la hotte pendant environ 5 min
note: Le bateau de pesée sera utilisé aux étapes 3.17.1.
- Récupérer le flacon de cellules qui seront évacuées de l’incubateur et amenées dans l’ESB. Inclinez doucement le ballon pour permettre aux cellules de couler au fond du milieu accumulé. Il y a environ 15 mL de milieu dans le ballon.
- Retirer environ 10 mL de support en portions de 5 mL (c.-à-d. 5 mL + 5 mL). Placez ces 10 mL de média dans un tube propre de 15 mL étiqueté « CM » pour « milieu conditionné ». Veiller à ne pas aspirer les cellules déposées dans les 5 mL de milieu restants dans la fiole ; ces cellules et 5 mL de milieu seront soumis à l’étape 3.8.
- Prélever 3 mL de milieu conditionné dans le tube « CM » (à l’étape 3.7) et les placer dans un tube de 15 mL étiqueté « solution inhibitrice de trypsine ». Il sera utilisé à l’étape 3.12. Après avoir retiré les 3 mL, il reste 7 mL de milieu conditionné dans le tube « CM ». Mettez le tube « CM » de côté jusqu’à l’étape 3.9.
- Retirer les 5 mL de milieu et les cellules restantes dans la fiole T75 et les placer dans un tube propre de 15 mL étiqueté « Cellules ».
- Prendre le tube « CM » contenant 7 mL de milieu conditionné (de l’étape 3.7.1) et rincer deux fois le fond de la fiole T75 avec des portions de 3,5 mL de milieu conditionné à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL. Après chaque rinçage, placez les portions de 3,5 ml dans le tube « Cells ». Le but de cette étape est de retirer toutes les neurosphères (cellules) de la fiole T75.
- Centrifuger le tube « Cellules » à 100 x g pendant 5 min à température ambiante. Pendant que les cellules tournent, obtenir une solution de dPBS/glucose à partir d’un bain-marie à 37 °C et ajouter la quantité appropriée de trypsine et de DNase conformément au tableau 2.
- Une fois que le tube « Cells » a cessé de tourner, retirez tout le surnageant de milieu conditionné et transférez-le dans le tube « CM ».
- Prenez le tube étiqueté « solution d’inhibiteur de trypsine » de l’étape 3.7.1 et ajoutez le volume d’inhibiteur de trypsine indiqué au tableau 3. Utilisez le même volume de solution d’inhibiteur de la trypsine que celui utilisé pour la solution de trypsine.
- Placez la solution inhibitrice de la trypsine dans le bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
- Ajouter la solution de trypsine à la pastille cellulaire dans le tube de 15 mL et pipeter de haut en bas environ 5 à 10 fois avec une pipette de 5 mL. Fermez le capuchon du tube et incubez au bain-marie à 37 °C pendant 5 min. Après 5 min, récupérez les cellules et pipetez de haut en bas 5 à 10 fois. Ensuite, incubez dans le bain-marie à 37 °C pendant 10 à 15 minutes supplémentaires.
- Au cours des 5 dernières minutes, déplacer la solution d’inhibiteur de trypsine dans le BSC.
- Récupérez les cellules une fois l’étape 2.14 terminée et pipetez les cellules de haut en bas jusqu’à ce que les sphères soient complètement dissociées (20 à 30 fois). Ensuite, ajoutez immédiatement la solution d’inhibiteur de trypsine et pipetez de haut en bas 10 fois. Cette solution de cellules dissociées et d’inhibiteur de la trypsine sera appelée « suspension cellulaire ».
- Comptez le nombre de cellules dans la suspension de cellules en suivant les étapes suivantes.
- Pipeter 15 μL de prémélange de Trypan Blue (contenant 5 μL de bleu de trypan à 0,4 % et 10 μL de dPBS) dans une petite cuve de pesée, puis ajouter 5 μL de suspension cellulaire. Pipette de haut en bas 3 à 5 fois pour mélanger. Ensuite, pipeter 10 μL de Trypan Blue/suspension cellulaire de chaque côté d’un hémocytomètre recouvert d’une lamelle en verre.
- Observez les cellules au microscope optique et comptez le nombre total de cellules dans chacune des quatre grilles d’angle. Additionnez ces chiffres.
- Répétez le comptage pour l’autre côté et faites la moyenne des deux côtés ensemble.
- Multipliez ce nombre par 10 000 pour obtenir le nombre total de cellules par ml. Multipliez ce nombre par le nombre total de millilitres pour calculer le nombre total de cellules dans la suspension cellulaire. Calculez le volume de suspension cellulaire nécessaire pour ensemencer 5 millions de cellules par flacon T75.
note: En règle générale, après 9 à 10 jours, un T75 aura 25 à 30 × 106 cellules. Par conséquent, si l’on fait passer toutes les cellules dans de nouveaux flacons, un total de 5 à 6 flacons est nécessaire.
- Ajouter le volume de suspension cellulaire calculé à l’étape 3.19 dans chaque fiole T75 pour obtenir 5 × 106 cellules par fiole. Si le volume est inférieur à 5 ml, ajoutez un produit d’affection supplémentaire pour obtenir un total de 5 ml. Ajouter ensuite 10 mL de nouveau milieu DFHGFPS contenant des facteurs de croissance (tableau 1) dans la fiole.
- Répétez les étapes 1.17 et 1.18 et assurez-vous que le flacon est étiqueté avec le type de cellules, les dates, le nombre de cellules dans le ballon et le numéro de passage (il s’agit du nombre de fois où la cellule a été franchie). Ensuite, passez à l’étape 4.
- Si nécessaire, ensemencez des cellules supplémentaires dans une fiole T75 à une densité allant jusqu’à 30 × 10à 6 cellules par fiole pendant la nuit et congelez le lendemain conformément à l’étape 4.
4. Congélation et stockage des hNSC
- Le lendemain du passage, récupérer la fiole de l’incubateur contenant les cellules pour la congélation (étapes 3.19 et 3.22). Inclinez le ballon et retirez tout le milieu et les cellules du ballon, puis placez-le dans un tube de 15 ml. Ensuite, centrifugez le tube à 216 x g pendant 5 min.
- Pendant le processus de centrifugation, préparez le fluide de congélation (tableau 4). Pour chaque tranche de 5 × 106 cellules, préparer 1 mL de produit de congélation. Le nombre de cellules a été déterminé à l’étape 3.19 pour déterminer le nombre de cellules à mettre dans chaque flacon. Ce nombre n’aura pas changé du jour au lendemain.
- Préparez des flacons de cryoconservation avec des étiquettes indiquant le nom de la cellule, le numéro de passage, le numéro de cellule, les initiales et la date. Après la centrifugation, éliminer le surnageant par aspiration et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de congélation de manière à ce qu’il y ait 5 × 106 cellules/mL. À l’aide d’une pipette de 5 ml, aliquote 1 mL par flacon et fermer hermétiquement (5 × 106 cellules par flacon).
- Placez les flacons dans un récipient de cryoconservation contenant 250 ml d’isopropanol (l’utilisation maximale est de 5 fois par remplacement d’isopropanol). Conserver dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit, puis transférer dans un système de stockage de réservoir d’azote liquide.
5. Placage hNSC adhérent pour la validation
- La veille du passage (étapes 3.1-3.22), nettoyez l’ESB comme à l’étape 2.2 et procurez-vous une plaque à 24 puits et des lamelles en verre stérile de 12 mm.
- À l’aide d’une pince, placez une seule lamelle au fond de chaque puits de la plaque.
- Enduire les puits contenant des lamelles avec 0,01 % de poly-D-lysine (PDL) dans de l’eau stérile et incuber pendant 1 h à 37 °C. Pour une plaque de 24 puits, utilisez 250 μL de PDL par puits.
- Retirez le PDL des puits, puis enduisez-le de 1 μg/cm2 de laminine/dPBS (250 μL par puits). Incuber la plaque toute la nuit à 37 °C. Si vous n’en avez pas besoin le lendemain, scellez la plaque avec du parafilm en enroulant le parafilm sur les bords de la plaque et conservez-la à 4 °C
note: Les plaques recouvertes de laminine peuvent être stockées jusqu’à 2 semaines si elles sont scellées avec du parafilm tant que les lamelles ne sèchent pas.
- Cellules de passage comme décrit aux étapes 3.1 à 3.22, puis déterminer le nombre de cellules à ensemencer dans la plaque à 24 puits avec lamelles revêtues.
- Retirer tout excès de solution de laminine des puits par aspiration et rincer une fois avec 0,5 mL de dPBS. Ensuite, ensemencez les cellules dans les puits à une densité de 0,6-1 x 105 cellules/cm2 par puits. Utilisez les cellules restantes conformément aux étapes 3.16 à 3.21.
- À divers moments au cours de la culture sur plaque de 24 puits, fixez et colorez les cellules pour divers marqueurs de cellules souches.