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1. Génération d’agrégats iPSC
- Génération de cultures monocouches unicellulaires à partir de colonies d’iPSC
- Préparez une plaque à 6 puits recouverte d’extrait de membrane basale (BME). Décongelez le BME sur la glace à 4 °C pendant 2 à 3 h, diluez-le avec du Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 froid (DMEM-F12 ; dilution 1:50), couvrez la plaque avec 1 mL/puits de la solution diluée de BME et conservez la plaque pendant la nuit à 4 °C.
- Aspirer le milieu et laver les colonies intactes d’au moins deux puits d’une plaque à 6 puits avec 0,5 mM d’EDTA dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois avant d’incuber les colonies avec 0,5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS pendant 4 min à température ambiante (RT). Aspirez la solution d’EDTA et détachez doucement les colonies en les lavant du fond du plat avec 5 ml de milieu DMEM-F12. Récupérez-les dans un tube de 15 mL et granulez-les par centrifugation (4 min à 1 200 x g à RT).
REMARQUE : Des iPSC reprogrammées à partir de fibroblastes disponibles dans le commerce ont été utilisées avec succès.
- Aspirez le surnageant et incubez les colonies d’iPSC avec 500 μL de réactif de dissociation cellulaire pendant 6 min à 37 °C.
- Pipetez doucement la suspension cellulaire plusieurs fois vers le haut et vers le bas avec une pipette de 1 ml pour briser les grappes de cellules restantes en cellules individuelles.
- Ajouter 4 mL de DMEM-F12 à la suspension cellulaire pour diluer le réactif de dissociation cellulaire.
- Faites tourner les cellules à 1 200 x g pendant 4 min à RT.
- Remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu iPSC complété par 5 μM d’Y-27632 et semer les cellules dans un puits d’une plaque à 6 puits recouverte de BME.
note: Utilisez le milieu iPSC spécifié dans la Table des matériaux pour une culture iPSC monocouche unicellulaire.
- Le lendemain, remplacez le support par un support iPSC frais manquant de Y-27632. À partir de ce moment, continuez à cultiver les cellules, en changeant de milieu tous les jours jusqu’à ce que les iPSC soient 100 % confluents. En fonction de la lignée cellulaire et de la confluence des puits de départ, cela prendra entre 2 et 4 jours.
- Une fois confluents, passez les iPSC. Aspirez le milieu et appliquez 500 μL de réactif de dissociation cellulaire sur les cellules.
- Incuber les cellules pendant 5 à 10 minutes à 37 °C. Secouez doucement la plaque pour détacher les cellules.
- Lavez les cellules du puits à l’aide de 2 ml de DMEM-F12 et recueillez-les dans un tube de 15 ml. Ajouter le DMEM-F12 pour un volume total de 5 ml.
- Faites tourner les cellules à 1 200 x g pendant 4 minutes à RT et aspirez le surnageant.
- Ensemencer les cellules dans un milieu iPSC complété par 5 μM d’Y-27632 dans un rapport de 1:2 à 1:4 sur une plaque à 6 puits recouverte d’un BME (2 mL/puits de milieu).
- Continuez à cultiver les cellules pendant 2 à 5 jours et changez chaque jour le milieu iPSC manquant de Y-27632. Une fois confluent, passage des iPSC (étapes 1.1.4-1.1.8).
note: Cultivez les iPSC pendant au moins 2 passages en tant que monocouche dans le milieu iPSC spécifié dans la Table des matériaux avant de les utiliser pour la génération d’agrégats iPSC afin de permettre aux cellules de s’adapter aux conditions de culture.
- Utiliser des cultures iPSC monocouches lorsqu’elles sont confluentes à 70-90 % pour la génération d’agrégats iPSC.
REMARQUE : iPSC adapté aux conditions de culture car les cellules uniques sont moins sujettes au stress qui conduit à la mort cellulaire pendant la procédure de dissociation et d’agrégation. Les cultures monocouches d’iPSC doivent présenter une morphologie pluripotente typique sans signe de différenciation. Testez régulièrement les cultures pour détecter la contamination par les mycoplasmes. Ne travaillez qu’avec des cultures d’iPSC exemptes de mycoplasmes.
- Aspirez le milieu de culture à partir d’un puits d’une plaque à 6 puits et appliquez 500 μL de réactif de dissociation cellulaire sur les cellules.
- Incuber les cellules pendant 5 à 10 minutes à 37 °C. Secouez doucement la plaque pour détacher les cellules.
- Lavez les cellules du puits à l’aide de 2 ml de DMEM-F12 et recueillez-les dans un tube de 15 ml. Ajouter le DMEM-F12 pour un volume total de 10 ml.
- Pour le comptage des cellules, prélevez 25 μL de la suspension cellulaire et mélangez-le avec 25 μL de bleu trypan pour marquer les cellules mortes. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’une chambre de comptage.
- Prélever suffisamment de cellules (4 500 cellules par agrégat d’iPSC) de la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml.
- Faites tourner les cellules à 1 200 x g pendant 4 minutes à RT et aspirez le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension dans un volume approprié de milieu iPSC complété par 50 μM d’Y-27632 pour obtenir 4 500 cellules vivantes par 150 μL.
note: L’utilisation d’une forte concentration d’Y-27632 (50 μM) est essentielle à la survie des CSPi.
- Plaquez 150 μL dans chaque puits d’une plaque à fond en U de 96 puits à faible fixation et placez-la dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2,
note: Lors de la génération d’agrégats iPSC, considérez qu’au moins 6 organoïdes sont nécessaires pour le contrôle de la qualité au jour 20 (voir Section 5).
2. Induction du neuroectoderme antérieur
- Surveillez de près les changements morphologiques des agrégats iPSC chaque jour sous le microscope de culture tissulaire à l’aide d’une lentille de puissance 4X ou 10X. Observer au jour 1, les agrégats cellulaires avec des bordures claires. Continuer à cultiver les agrégats d’iPSC dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2,
note: Un certain nombre de cellules mortes/puits est normal et n’affectera pas la génération d’organoïdes.
- Nourrissez les agrégats iPSC à partir du jour 2 et en continuant tous les deux jours en aspirant doucement environ 2/3 du milieu sans perturber les agrégats cellulaires au fond. Ajouter 100 μL supplémentaires de milieu iPSC sans Y-27632.
note: En 4 à 6 jours, les agrégats cellulaires auront un diamètre de 350 à 450 m et présenteront des bords lisses.
- À ce stade, regrouper les agrégats cellulaires avec une pointe de pipette coupée de 100 μL dans une boîte de 6 cm à faible fixation (maximum 20 agrégats/boîte) dans un milieu d’induction corticale contenant du DMEM-F12 avec un supplément de N2 (1:200), un supplément de B27 (1:100), du glucose (0,2 mg/mL), de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc ; 0,15 μg/mL), 0,5 % d’acides aminés non essentiels (NEAA), 1 % de L-alanyl-L-glutamine, d’héparine (10 μg/mL) et les composés LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) et inhibiteur de la réponse Wnt-1 (IWR-1) (10 μg/mL). Nourrissez les agrégats cellulaires en changeant le milieu d’induction corticale 3 jours après les avoir transférés dans la parabole de 6 cm.
- Surveillez de près les changements morphologiques lors de l’induction corticale au microscope de culture tissulaire à l’aide d’une lentille de puissance 4X.
note: Après 4 à 5 jours dans un milieu d’induction corticale, les bords des agrégats cellulaires devraient commencer à s’éclaircir à la surface, indiquant une différenciation neuroectodermique. À ce stade, l’organisation radiale d’un épithélium pseudostratifié émerge. Passez à la section 3 pour intégrer les agrégats de cellules dans une matrice BME.
3. Intégration d’agrégats neuroectodermiques dans un échafaudage matriciel
- Décongeler le BME sur de la glace à 4 °C pendant 2-3 h. Aliquote non dilué BME en quantité suffisante.
- Préparez une feuille de film de paraffine plastique pour la procédure d’enrobage. Coupez le film de paraffine plastique à l’aide de ciseaux stériles en morceaux de 4 cm x 4 cm de large, placez un morceau du film de paraffine plastique sur un plateau d’embouts vide de 100 μL pour les embouts de 100 μL, et appuyez avec un doigt ganté de manière à créer de petites fossettes dans la feuille de film de paraffine plastique (1 alvéole/agrégat de cellules nécessaire). Nettoyez le film de paraffine plastique avec de l’éthanol à 70 % et irradiez-le avec de la lumière UV (puissance : 15 watts, longueur d’onde : 435 nm) sous la paillasse stérile fermée pendant 30 min.
- Transférez chaque agrégat de cellules sur une fossette de la feuille de film de paraffine en plastique à l’aide d’une pointe coupée de 100 μL avec une ouverture de 1,5 à 2 mm de diamètre. Dans le cas où deux agrégats de cellules sont fusionnés, ne les séparez pas, mais transférez-les ensemble dans une seule fossette.
- Aspirez doucement le milieu entourant les agrégats de cellules à l’aide d’une pointe de pipette non coupée de 100 μL.
note: Veillez à ne pas aspirer les agrégats cellulaires dans la pointe, car cela endommagerait les agrégats.
- Ajouter 40 μL de BME non dilué à chaque agrégat de cellules.
- Positionnez chaque agrégat de cellules au milieu de la goutte BME à l’aide d’une pointe de pipette non coupée de 100 μL.
note: Faites très attention à ne pas endommager le neuroépithélium en développement avec la pointe de la pipette.
- Transférez soigneusement la feuille de film de paraffine plastique à l’aide d’une pince stérile dans une boîte de Pétri de 10 cm (ou une autre boîte de culture cellulaire suffisante) et placez la boîte dans l’incubateur pendant 15 à 20 minutes pour permettre au BME de se solidifier.
- Entre-temps, préparez un plat de 6 cm contenant 5 ml de milieu d’induction corticale.
- Après la polymérisation du BME, retirez les gouttelettes contenant les agrégats cellulaires de la feuille de film de paraffine plastique. À l’aide d’une pince stérile, retournez le film de paraffine en plastique et pressez doucement les agrégats cellulaires dans le plat de 6 cm légèrement incliné (environ 30 °) à faible fixation jusqu’à ce que les gouttelettes tombent de la feuille de film de paraffine en plastique. Transférez un maximum de 16 agrégats de cellules dans une boîte de 6 cm.
- Continuez à incuber les agrégats cellulaires à 37 °C.
4. Génération d’organoïdes de type cerveau antérieur à partir d’agrégats neuroectodermiques
- Un jour après l’enrobage dans une matrice BME, placez les plats de culture organoïde sur un agitateur de culture cellulaire à bascule avec un angle d’inclinaison de 5 ° et 14 tr/min, installé dans un incubateur de culture cellulaire.
- Surveillez les organoïdes tous les jours. Des structures neuroépithéliales homogènes en forme de boucle se développent progressivement après l’intégration dans la matrice BME.
- Lorsque les structures de l’anse neuroépithéliale sont visibles, remplacer le milieu par un milieu de différenciation organoïde contenant du DMEM-F12 avec supplément de N2 (1:200), supplément de B27 (1:100), glucose (0,2 mg/mL), AMPc (0,15 μg/mL), 0,5 % d’AENA, 1 % de L-alanyl-L-glutamine, insuline (2,5 μg/mL)
- Remplacez le milieu de différenciation des organoïdes tous les 3-4 jours jusqu’à ce que le point de différenciation souhaité soit atteint. Ensuite, fixez les organoïdes (voir Section 5).
note: Parfois, le tissu peut présenter des bourgeons de tissu optiquement translucide sans structures en boucle. Bien que ce ne soit pas idéal, cela n’affecte pas le développement des structures corticales. Les organoïdes peuvent être cultivés dans un milieu de différenciation organoïde jusqu’à 40 jours. Pour des périodes de culture prolongées (40 à 100 jours), le milieu de différenciation des organoïdes peut être complété par 1:50 BME pour augmenter la complexité des tissus et par du BDNF et du GDNF pour permettre la survie et la maturation neuronales.