Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Configuration de base et préparation du milieu de culture
- Le jour de la dissection, préparer la quantité appropriée de milieu de croissance correspondant au milieu sans sérum (SFM) composé du milieu d'aigle modifié de Dulbecco [(DMEM)/F12 avec L-glutamine] (Table des matériaux) complété par 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (pen/streptocoque), 1 % B27, avec également 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF) et 5 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF). Réchauffer le milieu de culture à 37 °C dans un bain-marie.
REMARQUE : Le volume du milieu de croissance dépend du nombre de petits, pour 5 petits, préparez ~100 mL (50 mL pour la zone sous-ventriculaire (SVZ) et 50 mL pour le gyrus denté (DG)) ; Cependant, après avoir compté le nombre de cellules (étape 4.1), le volume exact devra être ajusté.
- Pour la microdissection de la SVZ et de la DG, préparez le milieu de dissection de la solution saline équilibrée de Hanks, sans calcium ni magnésium, complété par 100 U/mL de pénicilline/streptomycine (pen/streptocoque).
REMARQUE : Préparez 50 à 100 ml de milieu de dissection.
- Installez un microscope de dissection et préparez les outils nécessaires pour enlever le cerveau (ciseaux et petite spatule) et pour les microdissections SVZ et DG (petits ciseaux Dumont, pinces #7, pinces #5 #5S pinces) en trempant dans de l’éthanol à 70 %.
2. Prélèvement de cerveaux de souris postnatals (P1−3) et microdissections SVZ/DG
- Préparez des boîtes de Pétri de 60 mm (zone de croissance de 21 cm2) avec du HBSS complété par un stylo/streptocoque et 2 tubes d’échantillon (un pour SVZ et un pour DG) avec 500 μL de HBSS supplémenté chacun.
- Euthanasier les bébés souris (P1-3) conformément au protocole approuvé par l’établissement de soins aux animaux de l’établissement/lignes directrices. Effectuez la décapitation avec une seule incision avec des ciseaux tranchants à la base du tronc cérébral.
- En tenant la partie ventrale du corps à la base de la tête et à l’aide de petits ciseaux pointus, faites une incision médiane dans la peau sur toute la longueur de la tête, révélant ainsi la surface du crâne.
- Faites une incision longitudinale à la base du crâne et continuez à couper le long de la suture sagittale à l’aide de petits ciseaux avec un angle aussi peu profond que possible afin d’éviter d’endommager les structures cérébrales.
- Pelez le crâne sur les côtés à l’aide d’une pince incurvée et exposez le cerveau.
prudence: Assurez-vous que les instruments de dissection sont exempts d’éthanol avant de toucher le cerveau.
- Isolez le cerveau du crâne à l’aide d’une petite spatule, en glissant sous la base du cerveau pour couper les nerfs crâniens et les vaisseaux sanguins qui sont reliés à la base du cerveau, et transférez le cerveau dans une boîte de Pétri contenant une solution HBSS supplémentée en froid.
- Placez la boîte de Pétri contenant le cerveau sous un microscope de dissection à faible grossissement et positionnez le cerveau sur sa surface dorsale.
- À l’aide d’une pince fine, retirez les méninges de la face ventrale du cerveau et les bulbes olfactifs, tout en maintenant le cerveau en position par le cervelet. Faites pivoter le cerveau sur la face ventrale et décollez le reste des méninges.
REMARQUE : L’ablation des méninges dorsales est une étape cruciale pour assurer un tranchage cérébral correct.
- Jetez le cervelet en faisant une incision à l’aide d’une pince. Placez un papier filtre avec une taille de pores de 11 μm sur un hachoir à tissus (Table des matériaux) et placez le cerveau sur le papier filtre à l’aide d’une pince à pointes incurvées. Coupez le cerveau en sections coronales de 450 μm et utilisez une lame humide pour recueillir le cerveau sectionné dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de HBSS supplémentée en froid.
- Pour disséquer la SVZ, utilisez une pince pour séparer les tranches coronales d’avant en arrière jusqu’à ce que vous atteigniez les tranches avec les ventricules latéraux, sous un microscope de dissection.
- Coupez la fine couche de tissu entourant la paroi latérale des ventricules (qui correspond à la ZVS) à l’aide d’une pince fine, à l’exclusion du parenchyme striatal et du corps calleux. Isolez la ZVS en plaçant l’extrémité de la pince dans les coins latéraux du ventricule latéral : l’un immédiatement sous le corps calleux et l’autre dans le tissu immédiatement adjacent à la région ventrale du ventricule latéral. Ensuite, coupez une petite ligne de tissu entourant le ventricule latéral.
- Prélever le tissu disséqué dans un tube d’échantillon avec une solution HBSS supplémentée précédemment identifiée comme SVZ.
REMARQUE : Exclure la SVZ dans les tranches où les ventricules latéraux et la formation de l’hippocampe commencent à apparaître.
- Traversez toutes les tranches après la microdissection SVZ de manière antérior-postérieure et atteignez la formation hippocampique. À l’aide d’une force, jetez la première tranche avec l’hippocampe où la DG est encore méconnaissable.
- Pour retirer le DG, isolez d’abord l’hippocampe des tranches. Ensuite, recentrez le microscope pour visualiser les bordures autour de la DG.
- Disséquez la partie MD en effectuant une coupe entre les régions DG et CA1, suivie d’une coupe verticale entre les régions DG et CA3 à l’aide d’une pince. Retirez le fimbria et tout tissu adjacent.
REMARQUE : Chez les animaux P1-3, la DG est presque impossible à distinguer de la corne d'Ammon mais présente une petite pointe.
- Prélever le tissu disséqué dans un tube d’échantillon contenant des solutions HBSS supplémentées précédemment identifiées comme DG.
REMARQUE : Une blessure globale à l’hippocampe ou à la zone environnante rendra plus difficile l’isolement du DG. L’utilisation d’un atlas du cerveau postnatal de la souris est essentielle lorsque l’utilisateur n’est pas familier avec l’isolement des tissus SVZ et DG des coupes coronales.
3. Dissociation tissulaire
- Pour dissocier les tissus SVZ et DG présents dans leurs tubes respectifs, ajoutez de l’acide trypsine-éthylènediamine tétraacétique (trypsine-EDTA) à 0,05 % pour obtenir une concentration finale de 5 à 10 % de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le HBSS. Incuber pendant environ 15 minutes à 37 °C, jusqu’à ce que les tissus soient agglomérés.
- Lavez le tissu de la trypsine en retirant le milieu et en ajoutant 1 mL de nouvelle solution supplémentée en HBSS pendant 4 fois consécutives.
- Retirer le HBSS et remettre en suspension le tissu digéré dans 1 mL de SFM complété par 10 ng/mL d’EGF et 5 ng/mL de bFGF. Dissociez mécaniquement la pastille en la pipetant doucement de haut en bas d’environ 7 à 10 fois à l’aide d’une pipette P1000, jusqu’à l’obtention d’une solution cellulaire homogène.
prudence: Une dissociation mécanique excessive peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire et aura un impact négatif sur la croissance cellulaire ultérieure.
4. Expansion des cellules souches neurales postnatales en tant que neurosphères
- Pour déterminer la densité de la suspension de cellules SVZ ou DG dissociées (obtenue dans la section 3), comptez les cellules à l’aide d’un hématocytomètre.
- Diluer la suspension unicellulaire SVZ et DG à une densité de 2 x 104 cellules/mL dans du SFM complété par 10 ng/mL d’EGF et 5 ng/mL de bFGF. Semez les cellules SVZ et DG dans des boîtes de Pétri de 60 mm non enrobées d’un volume final de 5 ml/boîte de Pétri
.
- Incuber les cellules SVZ et DG pendant 6 à 8 jours et 10 à 12 jours, respectivement, pour former des neurosphères primaires, à 37 °C avec 5 % de CO2.
REMARQUE : Le nombre de jours d’incubation supérieur à ceux mentionnés peut favoriser l’agrégation des neurosphères et des niveaux plus élevés de mort cellulaire au centre de la neurosphère.
- Lorsque la majorité des neurosphères ont un diamètre de 150−200 μm, effectuez le passage de la neurosphère.
REMARQUE : Le passage des neurosphères lorsqu’elles n’ont pas un diamètre approprié compromet toutes les étapes suivantes.
5. Passage des neurosphères
REMARQUE : Le protocole suivant peut être appliqué pour étendre les neurosphères SVZ et DG.
- Pour faire passer les neurosphères, prélever le SFM avec des facteurs de croissance contenant des neurosphères dans la ou les boîtes de Pétri de 60 mm et centrifuger pendant 5 minutes à 300 x g.
- Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de neurosphère à l'aide d'un kit de dissociation chimique (souris) selon les instructions du fabricant (Table des matériaux).
REMARQUE : Observez précisément les temps d’incubation car ils sont cruciaux pour la performance.
- Centrifuger pendant 5 min à 300 x g, retirer le surnageant et ajouter 1 mL de SFM complété par 10 ng/mL d’EGF et 5 ng/mL de bFGF.
- Triturez de haut en bas environ 10x avec une pipette P1000 pour dissocier les neurosphères.
- Comptez le nombre de cellules à l’aide d’une solution contenant 0,2 % de bleu de trypan et d’un hématocytomètre.
- Réensemencer les cellules à une densité de 2 x 104 cellules/mL dans des boîtes de Pétri de 60 mm non enrobées.
- Incuber les cellules SVZ et DG pendant 6 à 8 jours et 10 à 12 jours, respectivement, pour obtenir des neurosphères secondaires, à 37 °C avec 5 % de CO2.
REMARQUE : La capacité d’auto-renouvellement des NSPC dérivées de SVZ et de DG peut être accessible en suivant les sections 5 et 6 du protocole. Pour cela, ensemencez les cellules SVZ et DG à une densité de 1,0 x 104 cellules/mL (dans des plaques non revêtues à 24 puits) dans un milieu de croissance SFM contenant 5 ng/mL d’EGF et 2,5 ng/mL de bFGF (faible EGF/bFGF). Comptez le nombre de neurosphères primaires et secondaires résultantes.
