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1. Préparation du matériel nécessaire à la culture iPSC et à la différenciation BEC.
- Revêtement matriciel en plastique de culture tissulaire (TC) pour la culture IMR90-4 iPSC
- Aliquote du gel matriciel de la membrane basale (p. ex., Matrigel) en aliquotes de 2,5 mg et stockez-le à -20 °C
note: Travaillez rapidement lors de la manipulation du gel matriciel et de l’aliquote sur de la glace, car il forme un gel au-dessus de 4 °C et ne peut pas être aliquote une fois qu’il s’est solidifié.
- Pour revêtir le plastique TC, ajoutez rapidement une aliquote de gel matriciel à 30 mL de milieu DMEM/F12 modifié de Dulbecco dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 1 mL du milieu sur le gel matriciel congelé, pipeter de haut en bas jusqu’à ce qu’il soit décongelé, puis transférer immédiatement dans le tube conique de 50 mL avec le milieu restant.
- Utiliser 1 mL de cette solution d’enrobage de gel matriciel par puits d’une plaque à 6 puits et 12 mL par fiole T75.
note: Le plastique TC enduit de gel Matrix peut être préparé jusqu’à deux semaines avant d’être utilisé. Il est toutefois essentiel d’éviter que la solution de gel matriciel ne se dessèche, ce qui peut nécessiter l’ajout occasionnel de plus de DMEM/F12 sur le dessus des puits.
- Préparez le milieu d’entretien des cellules souches en ajoutant 50 ml de supplément 50x à 450 ml de milieu de base d’entretien des cellules souches dans l’environnement stérile d’une enceinte de sécurité biologique.
- Pour préparer 500 mL de milieu non conditionné (UM), combinez 392,5 mL de DMEM/F12 avec 100 mL de sérum de remplacement (KOSR), 5 mL d’acides aminés non essentiels, de la L-glutamine à une concentration finale de 1 mM et 3,5 μL de β-mercaptoéthanol. Filtrez-stérilisez et conservez à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Pour préparer 200 mL de milieu de cellules endothéliales (CE) plus de l’acide rétinoïque (AR) et du bFGF, combinez 198 mL de milieu libre sérique endothélial humain (hESFM), 2 mL de sérum dérivé pauvre en plaquettes (PDS) stérilisé par filtre et 20 ng/mL de bFGF. Filtrer, stériliser et conserver jusqu’à 2 semaines à 4 °C. Juste avant l’ajout aux cellules, ajoutez 10 μM de RA au milieu EC.
note: Comme la PDS a été abandonnée et peut donc être limitée, ce protocole a été mené avec succès en utilisant la B27 à la place de la PDS.
- Pour préparer 200 mL de milieu EC sans PR ou bFGF, combinez 198 mL de hESFM et 2 mL de PDS stérilisé par filtre et stérilisez par filtre. Conserver jusqu’à 4 semaines à 4 °C.
2. Différenciation des cellules endothéliales cérébrales à partir des iPSC humaines
- Placage des iPSC pour la différenciation (jour-3 du protocole de différenciation)
- Selon l’IMR90-4, bien cultiver en plaque pour la différenciation, aspirer le milieu de culture, ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire enzymatique par puits et incuber à 37 °C pendant 7 min.
- Inactiver le réactif de dissociation cellulaire enzymatique en transférant 1 mL de suspension cellulaire dissociée dans un tube conique de 15 mL avec au moins 2 mL de milieu d’entretien de cellules souches fraîches pour 1 mL de cellules. Faites tourner la suspension cellulaire à 1 500 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu d’entretien des cellules souches par puits de cellules IMR90-4 utilisées, et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
note: Il peut être utile de diluer 1:1 avec 0,4 % de bleu de trypan pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes lors du comptage. Selon la densité des CSPi, un puits d’une plaque à 6 puits produit généralement 1\u20122 x 10cellules 6.
- Pour la différenciation dans une fiole T75, ajouter 7,5 x 105 cellules à 12 mL de milieu d’entretien des cellules souches et un inhibiteur de ROCK (dichlorhydrate Y27632) à une concentration finale de 10 μM. Aspirer une solution d’enrobage de gel à matrice d’un ballon T75 et transférer la suspension cellulaire dans le ballon. Répartissez les cellules de manière égale en agitant le ballon d’avant en arrière et de gauche à droite et incubez à 37 °C et 5 % CO2.
note: Il est essentiel d’ajouter un inhibiteur de ROCK à cette étape pour améliorer la survie des cellules souches uniques dissociées. Les cellules doivent être uniformément réparties dans le ballon et dans les singlets présentant une morphologie étalée, semblable à celle du mésenchyme, en raison du traitement par inhibiteur de ROCK.
- Le jour -2 et le jour -1, remplacer le milieu par un milieu d’entretien à base de cellules souches fraîches ; 12 mL par T75.
- Le jour 0, commencez la différenciation en changeant le support en UM ; 12 mL par T75.
- Changer la messagerie unifiée tous les jours (jour 1 à jour 5).
note: Les cellules atteignent généralement la confluence après 2 à 3 jours dans l’UM, qui peut être observée à l’œil nu ou à travers un microscope à champ clair inversé. Au fur et à mesure que la différenciation progresse, les « voies neurales » nestin+ deviennent visibles avec des cellules PECAM-1+ entre les deux.
- Élargir sélectivement la population de cellules endothéliales en passant à un milieu EC avec 20 ng/mL de bFGF et 10 μM d’acide rétinoïque (AR) (jour 6) et en incubant pendant deux jours. Le milieu EC avec bFGF peut être préparé jusqu’à deux semaines à l’avance. L’AR est ajouté à partir de la pâte congelée le jour de l’utilisation (p. ex., 1 μL de 10 mM de pâte RA pour 1 mL d’EC + bFGF).
note: Une différenciation réussie peut également être obtenue sans supplémentation en PR aux jours 6 et 8. L’omission de l’AR entraînera toutefois des BEC avec un TEER réduit.
- Enduire les plaques de culture cellulaire et les inserts membranaires (par exemple, Transwell) avec du collagène IV et de la fibronectine (jour 7), pour la purification des BECs et après les expériences.
- Pour le revêtement des inserts membranaires, combinez 4 parties de collagène IV (1 mg/mL dans 0,5 mg/mL d’acide acétique), 1 partie de fibronectine (1 mg/mL) et 5 parties d’eau stérile de qualité tissulaire. La solution ECM peut être diluée à l’échelle 1:5 pour revêtir les plaques de culture cellulaire (c’est-à-dire 4 parties de collagène IV, 1 partie de fibronectine, 45 parties d’eau). Incuber avec une solution d’enrobage à 37 °C pendant la nuit.
REMARQUE : Les plaques et les inserts membranaires peuvent également être enduits pendant au moins 4 h avant la sous-culture le jour même de l’étape de purification.
- Purifier les BEC en sous-cultivant les cellules différenciées sur des plaques ou des inserts membranaires recouverts de collagène IV et de fibronectine (jour 8).
- Aspirer le milieu EC et ajouter le réactif de dissociation cellulaire enzymatique (12 mL par T75). Incuber à 37 °C jusqu’à ce que 90 % des cellules se soient détachées du ballon.
note: La dissociation cellulaire peut prendre jusqu’à 1 h.
- Pendant le temps d’incubation, retirez la solution d’enrobage de collagène IV/fibronectine des plaques/inserts préalablement préparés et laissez-les sécher dans une hotte stérile. Il faut environ 20 minutes pour que les inserts sèchent.
- Une fois les cellules détachées, lavez-les de la fiole à l’aide d’une pipette de 10 ml. Pipette vers le haut et vers le bas pour obtenir une suspension unicellulaire.
note: La suspension d’une seule cellule est importante pour un comptage fiable des cellules et pour obtenir des monocouches solides.
- Diluer avec un volume au moins égal de hESFM frais dans un tube conique de 50 mL et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Granulez les cellules à 1 500 x g pendant 10 min.
- Remettre en suspension les cellules dans un volume approprié d’EC + bFGF + RA fraîchement préparés pour obtenir une suspension de 2 x 106 cellules/mL pour l’ensemencement sur des inserts membranaires. Ajouter 500 μL (1 x 106 cellules) sur le dessus d’un insert à 12 puits et 1,5 mL de milieu EC + bFGF + RA sur le fond. Pour l’ensemencement sur des plaques de 24 et 48 puits, diluer la suspension cellulaire 1:2 et ajouter 500 μL (5 x 105 cellules) et 250 μL (2,5 x 105 cellules) par puits, respectivement. Répartissez uniformément les cellules dans le puits/insert et incubez à 37 °C sous 5 % de CO2.
- Changer le milieu sur les plaques/transpuits en EC sans bFGF ou RA (jour 9).