Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF)
Recueillir le tissu adipeux de l’arc périaortique (TAPA) de 5 à 6 souris dans un tube de microcentrifugation de 2 mL contenant 1 mL de milieu de digestion fraîchement préparé et hacher le tissu à l’aide de ciseaux chirurgicaux dans un tube d’Eppendorf à température ambiante (RT).
- Transférez le mélange dans des tubes de 50 ml contenant 9 ml de milieu de digestion. Homogénéiser les tissus en pipetant de haut en bas avec une pipette 10x de 1 mL.
- Incuber les tubes à 37 °C en les secouant constamment à 100 tr/min pendant 30 à 45 minutes et vérifier toutes les 5 à 10 minutes pour éviter une surdigestion. Ceci est essentiel pour améliorer la viabilité et le rendement cellulaires.
note: Une bonne digestion des tissus se traduira par un tissu adipeux homogène et jaune clair, visible à l’œil nu en faisant tourner doucement le tube.
- Arrêtez la digestion en ajoutant 5 mL de HDMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de PS v/v à RT et mélangez bien par pipetage.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à RT. Le SVF sera visible sous la forme d’une pastille brunâtre. Aspirez soigneusement les adipocytes flottants et décantez le surnageant restant sans perturber la FVS. Dissoudre la pastille de SVF dans 10 mL de milieu de culture et filtrer à travers une passoire cellulaire de 70 μm.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre doucement la pastille en suspension dans 5 mL de tampon de lyse érythrocytaire dans un tube conique de 15 mL pendant 10 min à RT.
- Arrêtez la réaction en ajoutant 10 ml de 1x PBS contenant 1 % de FBS. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à 4 °C, retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de 1x PBS contenant 1 % de FBS.
- Centrifuger à nouveau les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu de culture dans un tube conique de 15 mL à 4 °C.
- Après une dernière centrifugation (500 x g pendant 5 min à 4 °C), remettre en suspension les cellules granulées dans 5 mL de tampon FACS (PBS contenant 10 % de FBS, 100 unités/mL D’ADN I et 1 % v/v de PS) sur de la glace, et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
2. Isolement des NCADCs par FACS
- Configurez et optimisez le trieur de cellules en suivant le manuel d’instructions. Sélectionnez la buse de 100 μm, stérilisez les tubes de collecte, installez le dispositif de collecte requis et configurez les flux latéraux.
- Pour trier les cellules RFP+, un laser jaune/vert de 561 nm et un filtre optique 579/16 sont recommandés. Effectuez la compensation à l’aide de la commande négative et des commandes positives monocolorées. Voir la figure 1A pour le schéma de contrôle.
- Filtrez les cellules à travers une passoire de 40 μm, centrifugez-les à 500 x g pendant 5 min et mettez-les en suspension dans 2 mL de tampon FACS à une densité de 0,5–1 x 107/mL. Transférez les cellules dans des tubes de polystyrène à fond rond de 5 ml clairement étiquetés et chargez-les dans le trieur.
- Faites fonctionner le tube d’échantillon expérimental à 4 °C, allumez les plaques de déviation et triez-les dans un tube conique de 15 mL pré-enduit de RPMI contenant 1 % de FBS et 1 % v/v PS.
note: Protégez les échantillons de la lumière forte pour minimiser l’extinction RFP.
3. Culture des NCADCs
- Plaquez les cellules triées à une densité de 5 000 cellules/cm2 dans une plaque de culture à 12 puits dans un milieu de culture complet et incubez à 37 °C dans une atmosphère humide avec 5 % de CO2 pendant 20 à 24 h.
- Retirez le milieu de culture, lavez les cellules avec du PBS préchauffé (37 °C) pour éliminer les débris cellulaires et ajoutez du milieu de culture frais.
