Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation de solutions stériles de poly-D-lysine (PDL) et de laminine
- Au moins un jour avant l’isolement cellulaire, préparez des plaques recouvertes de poly-D-lysine (PDL) et de laminine.
note: Des plaques à 6 et 12 puits ont été préparées en fonction des objectifs expérimentaux. En règle générale, des plaques à 12 puits ont été utilisées pour l’analyse quantitative à l’aide de Western Blots, tandis que des plaques à 6 puits ont été utilisées pour maintenir des lamelles autoclavées (stériles) pour l’immunohistochimie. Des plaques à 24 puits ont été utilisées pour la culture de cellules gliales entériques (EGC) pour l’imagerie du flux Ca2+.
- Diluez des solutions mères avec de l’eau ultrapure de qualité culture tissulaire, sans DNase et sans RNase dans une hotte de culture tissulaire avec de l’air filtré HEPA.
- Stérilisation des lamelles en verre
- Tenez la lamelle à l’aide d’une pince stérile et plongez-la dans un bécher rempli d’éthanol à 100 % pendant 15 min. Laissez l’éthanol s’évaporer dans le capot de culture tissulaire, puis placez-le dans les plaques à 6 puits.
- Vous pouvez également placer plusieurs lamelles individuellement sur du papier buvard de 2 mm d’épaisseur dans un récipient en plastique, puis en autoclave.
2. Plaques de revêtement
REMARQUE : Effectuez ces étapes sous une hotte à flux laminaire de culture de tissus stériles.
- Décongeler 1 mg/mL de PDL et diluer 1:10 avec de l’eau stérile de qualité culture tissulaire jusqu’à ce que la concentration finale soit de 100 μg/mL. Utilisez 2 ml par puits pour enduire les plaques de 6 puits, 1 mL pour couvrir un puits d’une plaque de 12 puits et 0,5 mL pour un puits dans les plaques de 24 puits. Conserver le reste de la LDO diluée dans des aliquotes de 12 mL à -20 °C.
- Après avoir laissé le PDL enrober les puits pendant au moins 1 h, retirer le PDL à l’aide d’une pipette stérile. Laissez les plaques sécher complètement à l’air libre sous une hotte à flux laminaire de culture tissulaire.
note: Après avoir retiré la solution PDL à l’aide d’une pipette stérile, elle peut être utilisée deux fois de plus en 1 semaine après être passée à travers un filtre de 0,22 μm et stockée à 4 °C.
- Décongelez le stock de laminine sur de la glace pour éviter la formation de gel.
note: La laminine non diluée devient solide lorsqu’elle est chauffée à plus de 8 °C.
- Diluer la pellicule mère (0,5 mg/mL) à l'échelle 1:50 avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) stérile pour obtenir une concentration finale de 10 μg/mL. Conserver la laminine diluée dans 12 mL d’aliquotes à -20 °C.
- Ajouter de la laminine diluée dans les puits contenant du PDL séché. Utilisez 1 mL pour couvrir la surface à 6 puits et 0,5 mL pour couvrir le fond des plaques à 12 puits. Pour les lamelles, ajoutez 400 μL de laminine diluée dans les lamelles pour obtenir une couverture de surface.
- Incuber les plaques revêtues à 37 °C pendant 2 h, si la plaque est utilisée le jour même (revêtement rapide). Si ce n’est pas le cas, scellez les plaques avec une pellicule plastique et conservez-les toute la nuit à 4 °C (revêtement lent).
note: L’étanchéité est essentielle pour éviter le dessèchement et la contamination.
- Retirez soigneusement la solution de laminine à l’aide d’une pipette pour éviter de rayer la surface. Lavez doucement les puits trois fois avec du DPBS stérile.
- Ajouter un milieu de croissance glial complet dans chaque puits et maintenir les plaques à 37 °C jusqu’au moment d’ajouter la suspension EGC.
note: Les plaques revêtues de lysine et de laminine Poly-D peuvent être stockées pendant 3 jours à 4 °C. Enduire les plaques plusieurs jours à l’avance, puis les stocker à 4 °C ; laver les plaques avec de la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) stérile de Dulbecco à trois reprises. Ajouter 2 ml de DPBS stérile dans chaque puits après le lavage final. Fermez la plaque avec du parafilm et conservez-la à 4 °C. Il est essentiel de s’assurer que la laminine ne se dessèche pas.
3. Préparation des solutions d’isolation
- Préparez la solution de dissociation EDTA/HEPES/DPBS. Pour 500 mL de solution, utiliser du DPBS stérile (sans calcium ni magnésium) pour obtenir une solution finale de 10 mM d’HEPES et de 5 mM d’EDTA. À 490 mL de DPBS, ajouter 5 mL de tampon HEPES 1 M et 5 mL de solution mère EDTA 0,5 M. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
- Préparez le milieu de remise en suspension des cellules gliales à l’aide des réactifs indiqués dans le tableau 1.
- Préparer le milieu de croissance gliale à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 2.
note: Les milieux de croissance gliale contenant du GDNF peuvent être conservés pendant une semaine à 4 °C.
4. Élimination du segment intestinal
REMARQUE : Les souris ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau avant d’être euthanasiées par la méthode de largage d’isoflurane et de retirer un organe vital. Des souris C57BL/6 âgées de plus de 8 semaines ont été utilisées. Les deux sexes ont été utilisés sans différences notables dans la préparation.
- Euthanasiez la souris avec une surdose d’isoflurane et placez-la en décubitus dorsal dans un plateau de dissection. Épinglez les extrémités et stérilisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Tentez la peau avec des pinces, puis ouvrez l’abdomen avec des ciseaux.
- Soulevez le foie et identifiez l’estomac distal/le pylore. Ensuite, retirez 7 cm de l’intestin proximal. Attention à ne pas déchirer l’intestin.
- Tenez le pylore avec une pince tout en coupant le mésentère.
- Utilisez une dissection émoussée avec le dos des ciseaux pour gratter le pancréas adhérent.
- Placez le segment intestinal dans du DPBS glacé sans Ca2+ ou Mg2+ (Figure 1A).
note: D’autres segments de l’intestin ou du côlon peuvent également être retirés à l’aide de la même technique.
- À l’aide d’une seringue de 5 ou 10 ml fixée à une aiguille de 20 g à bout émoussé, rincer le contenu fécal à l’aide d’un DPBS glacé (figure 1B).
- Divisez l’intestin en segments de 3 cm pour retirer le muscle longitudinal. REMARQUE : Des segments intestinaux provenant d’un maximum de deux souris sont utilisés pour 30 ml de la solution d’isolement HEPES/EDTA/DPBS.
- Cassez environ 4 cm pour séparer le bâtonnet en bois de l’embout en coton. Trempez le bâton en bois dans du DPBS (Figure 1C).
- Glissez doucement l’un des segments intestinaux sur le bâtonnet mouillé (Figure 2A-C).
- Retirez le mésentère adhérent qui est toujours fixé à l’aide d’une pince à bec effilé (figure 2D).
- À l’aide d’une lame de rasoir ou d’un scalpel propre, faites deux entailles longitudinales le long de l’intestin où le mésentère était attaché (figure 2E).
- Mouillez l’embout en coton avec du DPBS. Frottez l’embout en coton mouillé longitudinalement le long du muscle pour desserrer le muscle longitudinal/plexus myentérique (LMMP). Ensuite, déplacez l’embout en coton horizontalement pour éloigner la LMMP du muscle circulaire le long de la longueur du segment intestinal lors de l’élimination de la LMMP.
- Tenez la pointe du bâton entre le pouce et l’index tout en stabilisant le segment avec le majeur et le quatrième doigt (Figure 2F). Une fois terminé, le LMMP se décollera facilement du segment intestinal.
- Jetez la PGMP prélevée dans le tube intestinal et fixée au coton-tige, à moins qu’il ne soit souhaitable de prélever des EGC du plexus myentérique.
- À l’aide d’une lame de rasoir, ouvrez le segment intestinal longitudinalement pour le retirer du bâtonnet en bois.
- Conservez le tissu intestinal dénudé (principalement la muqueuse et la sous-muqueuse ainsi que le muscle circulaire) dans le DPBS sur de la glace. Répétez les étapes 4.4 à 4.11 jusqu’à ce que tous les segments intestinaux soient prêts.
5. Ablation de la muqueuse épithéliale
- Coupez les intestins en petits morceaux de ~0,5 cm avec des ciseaux fins.
- Placez le tissu dans un tube à centrifuger conique stérile de 50 ml contenant 30 ml de solution glacée d’EDTA/HEPES/DPBS.
- Basculez la solution contenant du tissu à 4 °C pendant 10 min à ~60 inclinaisons par minute.
- Préhumidifiez une pipette en plastique de 5 mL en pipetant le tampon EDTA/HEPES/DPBS de haut en bas une fois, puis utilisez la pipette préhumidifiée pour pipeter le tissu et la suspension tampon de haut en bas (trituration) 20 fois pour déloger la muqueuse épithéliale.
- Prélevez le tissu de l’incubation EDTA en versant le mélange à travers une passoire à cellules en nylon de 100 μm. Jeter le liquide rempli de mucus trouble (figure 3).
- Placez le tissu retenu dans la crépine dans un nouveau tube à centrifuger conique de 50 mL contenant 30 mL d’EDTA/HEPES/DPBS glacé à l’aide d’une pince à bec effilé.
- Répétez l’incubation EDTA/HEPES/DPBS une deuxième fois en berçant le tissu à 4 °C pendant 10 minutes à ~60 inclinaisons par minute pour enlever la muqueuse épithéliale supplémentaire.
- Préhumidifiez une pipette de 5 mL avec le tampon, puis pipetez la suspension tissulaire de haut en bas 20 fois pour déloger les cellules muqueuses.
note: Le tissu aura tendance à coller à l’intérieur de la pipette à mesure qu’une plus grande partie de l’épithélium est retirée.
- Prélevez le tissu après la deuxième incubation en versant le mélange à travers une passoire en nylon de 100 μm et jetez le flux. Le deuxième flux doit être nettement moins trouble que le premier (figure 3).
- Répétez les incubations EDTA de 10 minutes jusqu’à ce que la solution soit presque claire (environ 3 à 4 incubations selon la quantité de tissu et l’efficacité de la trituration) (Figure 3).
6. Collection de cellules gliales entériques de la lamina propria et de la sous-muqueuse
- Transférez le tissu de la passoire en nylon dans un tube à centrifuger conique de 15 mL contenant 5 mL de la solution de récupération cellulaire disponible dans le commerce et basculez-le pendant 25 à 30 min à 4 °C.
- Triturer doucement 10x pour dissocier les cellules gliales entériques de la lamina propria.
- Filtrez à travers un filtre de 40 μm et collectez le filtrat dans un tube propre de 50 mL.
- Rincez le mouchoir du filtre en nylon avec 1 ml de DPBS.
- Jetez le tissu et transférez les ~5 à 6 ml de filtrat dans un tube à centrifuger conique propre de 15 ml.
- Faites tourner le filtrat à 2 000 x g dans une centrifugeuse à godets oscillants pendant 5 min à 4 °C.
- Remettez en suspension la pastille contenant des cellules gliales dans au moins 1 mL de tampon de remise en suspension en pipetant doucement la pastille de haut en bas à l’aide d’une pointe de pipette de 500 μL. Évitez d’introduire bubbles.
note: Ajustez le volume de remise en suspension selon les besoins en fonction du nombre de puits et de plaques. Par exemple, 1,2 mL pour une plaque à 6 puits, 2,4 mL pour deux plaques à 6 puits, 2,4 mL pour une plaque à 12 puits.
- Pipeter 200 μL de suspension cellulaire dans chaque puits des 6 puits ou 100 μL pour une plaque recouverte de laminine PDL à 12 puits contenant un milieu de croissance gliale.
- Ne dérangez pas les plats après avoir ajouté les cellules dans les plaques et les avoir placées dans l’incubateur à 37 °C pour permettre au maximum de cellules d’adhérer.
note: Une préparation saine de cellules se fixera dans les 6 à 8 heures, mais attendez au moins 24 h avant de changer de milieu en pipetant doucement le milieu avec des cellules non adhérentes.
- Utilisez les cellules pour des expériences 3 à 4 jours après leur mise en culture (Figure 4).
Table 1. Composition des milieux de suspension des cellules gliales.
| Composants | Volume à ajouter | Concentration finale |
| DMEM/F12 | 44,5 ml | _ |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | 5 mL | 10 % |
| Pénicilline-streptomycine | 500 μL | Stylo de 100 UI/mL |
| streptomycine | | 100 μg/mL de streptocoque |
| Gentamicine (50 mg/mL stock) | 20 μL | 20 μg/mL |
Tableau 2. Composition des milieux de croissance des cellules gliales
| Composants | Volume à ajouter | Concentration finale |
| DMEM/F12 | 44 ml | _ |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | 5 mL | 10 % |
| Pénicilline-streptomycine (100x) | 500μL | 100 UI/mL (stylo) |
| 100 μg/mL (streptocoque) | | |
| Gentamicine (50 mg/mL stock) | 20 μL | 20 μg/mL |
| GDNF (10 μg/mL de stock) | 50 μL | 10 ng/mL |
