Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Purification des capillaires du cerveau porcin
- Prélever 8 à 10 cerveaux de porcs domestiques âgés de 5 à 6 mois (par exemple dans un abattoir voisin) et les transporter sur de la glace jusqu’au laboratoire. Nous recommandons de commencer la procédure de purification suivante dans les 2-3 heures suivant l’élimination de l’animal.
- Placez les cerveaux dans une paillasse stérile et lavez-les délicatement avec 1 L de PBS dans un bécher posé sur de la glace.
- Retirez soigneusement les méninges d’un cerveau à la fois à l’aide d’une pince à pointe fine et transférez les cerveaux sans méninges dans un autre bécher de 1 L avec PBS placé sur de la glace. Prolonger le délai peut compliquer le retrait. Le temps approximatif utilisé pour chaque cerveau devrait être de 10 à 15 minutes.
- À l’aide d’un scalpel, grattez la matière grise d’un cerveau à la fois et transférez la matière isolée dans des boîtes de Pétri (8,8 cm2) contenant 20 mL de mélange nutritif DMEM F-12 (DMEM/F-12) placés sur de la glace. Isolez autant de matière grise que possible sans prélever de matière blanche. Pour une fragmentation initiale, passez la matière grise dans une seringue de 50 ml sans aiguille. Continuez pour tous les cerveaux et accumulez la matière grise collectée. Prolonger le délai peut compliquer le retrait. Le temps approximatif utilisé pour chaque cerveau devrait être de 10 à 15 minutes.
- Transférez la matière grise isolée dans le tube de broyage d’un homogénéisateur de mouchoirs à main dans un rapport de 50/50 avec un média DMEM/F-12. Homogénéisez le matériau en effectuant 8 coups de haut en bas avec un pilon lâche, suivis de 8 coups de haut en bas avec un pilon serré. Continuer jusqu’à ce que tout le matériel isolé ait été homogénéisé, puis transférer l’homogénat dans une bouteille de 500 mL et diluer avec du DMEM/F-12 jusqu’à un volume total d’environ 450 mL.
- Filtrez l’homogénat à l’aide d’un flacon à bouchon bleu de 500 ml avec porte-filtre et maille filtrante de 140 μm, et isolez les capillaires en faisant passer le tissu à travers le filtre. Utilisez un filtre par 50 mL d’homogénat et lavez ensuite chaque filtre avec du DMEM/F-12.
- Placez les filtres contenant des capillaires dans des boîtes de Pétri avec une solution de digestion de trypsine/EDTA (2,5 % de trypsine, 0,1 nM d’EDTA dans le PBS), de collagénase CLS2 (2 000 U/mL) et de DNase 1 (3 400 U/mL) dans du DMEM/F-12. Utiliser 1 boîte de Pétri (solution de 8,8 cm2, 20 ml) pour 3 mailles filtrantes.
- Placez les boîtes de Pétri à 37 °C pendant 1 h sur un agitateur orbital à 180 tr/min ou remuez-les doucement toutes les 10 min. Après 1 h, laver les capillaires des filtres en suspension de la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette de 1 ml.
- Divisez la suspension des 3 plats en 2 tubes de 50 mL et arrêtez la digestion en ajoutant 10 mL de DMEM/F-12 dans chaque tube de 50 mL.
- Centrifuger les suspensions cellulaires à 250 x g, 4 °C pendant 5 min. Aspirer les surnageants et remettre chaque pastille en suspension dans 10 mL de DMEM/F-12. Ajoutez 20 ml supplémentaires de DMEM/F12 dans chaque tube. Répétez cette étape de la centrifugeuse deux fois.
- Laissez les tubes refroidir sur de la glace pendant 5 minutes et transférez les solutions dans 2 nouveaux tubes de 50 ml.
- Centrifuger les suspensions cellulaires à 250 x g, 4 °C pendant 5 minutes, et remettre chaque pastille en suspension dans 8 à 10 mL (environ 1 mL/cerveau utilisé) d’une solution de congélation composée de 10 % de DMSO dans du FBS.
- Transférez la suspension cellulaire dans des cryoflacons, en utilisant 1 mL par cryoflan. En moyenne, la purification aboutit à 1 flacon par cerveau utilisé, fournissant en moyenne des cellules endothéliales pour 12 à 16 inserts. Placez les flacons dans une boîte de congélation à -80 °C pendant au moins 4 h jusqu’à toute la nuit. Ensuite, stockez les cryoflacons dans un réservoir cryogénique avec de l’azote liquide.
prudence: L’azote liquide a des températures extrêmement basses. Veuillez porter une protection appropriée.