Procédé d’isolement d’unités neurovasculaires à partir du cerveau de rat

Résumé

Source : Brzica, H., et al,. Une méthode simple et reproductible pour préparer des échantillons de membrane à partir de microvaisseaux de cerveau de rat fraîchement isolés. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre le processus d’isolement des microvaisseaux cérébraux des rats euthanasiés. Il comprend la dissection du cerveau, le nettoyage des tissus et la digestion mécanique, suivie d’une centrifugation répétée pour isoler la fraction pure des microvaisseaux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut. Le déroulement de la procédure du protocole est illustré à la figure 1.

1. Configuration de la procédure

1. Préparez le tampon pour microvaisseaux cérébraux (BMB). Commencez par peser 54,66 g de D-mannitol, 1,90 g d’EGTA (éthylène glycol-bis(2-aminoéthylether)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique) et 1,46 g de base 2-amino-2-(hydroxyméthyl)-1,3-propanediol (c’est-à-dire Tris) dans un bécher propre. Ajouter 1,0 L d’eau déminéralisée. Mélangez les composants du tampon BMB à l’aide d’un agitateur magnétique. Une fois que la solution a été bien mélangée, ajustez le pH à 7,4 en utilisant 1,0 M HCl.
2. Préparez une solution de dextran à 26 % (MW 75 000) (p/v) avant d’anesthésier les animaux. Suivez les étapes suivantes pour préparer le dextran solution.
   note: Il est extrêmement important de préparer cette solution à l’avance, car le dextran peut prendre environ 1,5 à 2 h pour se dissoudre dans un tampon aqueux.
   1. Pesez le dextran en poudre (26 g par tampon de 100 ml) dans un bécher propre.
   2. Mesurez le volume approprié de BMB et distribuez-le dans un bécher séparé et propre.
   3. Versez lentement dans le bécher le BMB contenant du dextran en poudre. Pendant le versement du BMB, mélangez manuellement le dextran en poudre à l’aide d’un agitateur en verre.
   4. Ajustez le pH à 7,4 avec 1,0 M HCl immédiatement avant utilisation.
      note: L’isolement typique des microvaisseaux cérébraux de 12 rats Sprague-Dawley (mâles ou femelles, âgés de 3 mois, de 200 à 250 g chacun) nécessite 200 mL de solution de dextran (c.-à-d. 52 g de dextran dans 200 mL de BMB).

2. Extraction de tissu cérébral de rats Sprague-Dawley

1. Après le traitement expérimental souhaité, anesthésier les rats Sprague-Dawley à l’aide de kétamine (50 mg/kg ; 2,5 mL/kg i.p.) et de xylazine (10 mg/mL ; 2,5 mL/kg I,p.). Diluer la kétamine et la xylazine dans une solution saline à 0,9 % jusqu’à des concentrations finales de 20 mg/mL et 4,0 mg/mL, respectivement. Euthanasiez les animaux par décapitation à l’aide d’une guillotine aiguisée conformément aux directives de l’IACUC (Institutional Animal Care & Use Committee). Utilisez la même procédure pour les rats Sprague-Dawley mâles et femelles.
2. Réséquez la peau du crâne du rat en faisant une seule coupe transversale à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
3. À l’aide d’un rongeur, retirez soigneusement la plaque crânienne et exposez le cerveau.
4. Retirez le cerveau à l’aide d’une spatule. Détachez le cerveau et placez le tissu cérébral isolé dans un tube conique de 50 ml contenant 5 ml de BMB. Ajouter 1,0 μL de cocktail d’inhibiteur de protéase pour 1,0 mL de tampon BMB immédiatement avant l’utilisation.

3. Traitement cérébral

1. Transférez le tissu cérébral du tube conique de 50 ml dans une boîte de Pétri propre.
2. À l’aide d’une pince, roulez doucement le cerveau sur du papier filtre de 12,5 cm de diamètre pour retirer les méninges externes, qui adhèrent lâchement au cortex cérébral. Appuyez doucement le tissu cérébral contre le papier filtre et roulez à nouveau le tissu. Retournez fréquemment le papier filtre au cours de cette étape.
3. Séparez le plexus choroïde des hémisphères cérébraux à l’aide d’une pince.
   note: Le plexus choroïde se présente sous la forme d’un tissu membraneux clair localisé à la surface des ventricules cérébraux.
4. Aplatissez doucement le tissu cérébral et retirez les méninges et les bulbes olfactifs restants à l’aide d’une pince.
5. Placez le tissu cérébral cortical dans un mortier de verre réfrigéré. Ajouter 5,0 ml de BMB contenant un cocktail inhibiteur de protéase au mortier.
6. À l’aide d’un homogénéisateur aérien, homogénéisez le tissu cérébral à l’aide de 15 mouvements de haut en bas à 3 700 tr/min. Effectuer l’homogénéisation à l’aide d’un mortier de 10 mL et d’un broyeur de tissus pilons. Entre l’homogénéisation de chaque échantillon individuel, nettoyez le pilon avec de l’éthanol à 70 %.
   note: Les traits d’homogénéisation doivent être cohérents en termes de rythme et d’amplitude.
7. Versez l’homogénat dans des tubes à centrifuger étiquetés.

4. Étapes de centrifugation

1. Ajouter 8,0 mL de solution de dextran à 26 % dans chaque tube à centrifuger étiqueté contenant de l’homogénat de cerveau.
2. Retournez le tube deux fois, puis tourbillonnez complètement l’échantillon. Effectuez le vortex de chaque échantillon en utilisant plusieurs angles pour assurer un mélange complet de la solution d’homogénat de cerveau avec une solution de dextran à 26 %.
3. Centrifuger les échantillons à 5 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
   note: Pour certaines analyses, il est utile de comparer les microvaisseaux cérébraux avec le parenchyme cérébral. Si l’évaluation de l’expression des protéines dans le parenchyme cérébral est nécessaire, le surnageant de cette étape de centrifugation (c’est-à-dire la fraction parenchymateuse cérébrale) peut être recueilli et stocké à -80 °C pour une utilisation future.
4. Prélever le surnageant à l’aide d’un aspirateur à vide et d’une pipette Pasteur en verre.
   note: Des précautions doivent être prises pour ne pas déranger le granulé. Sinon, la quantité de microvaisseaux cérébraux collectés sera réduite, ce qui diminuera considérablement le rendement en protéines de cette procédure.
5. Remettre la pastille en suspension dans 5,0 mL de cocktail d’inhibiteurs de protéase contenant du BMB (c.-à-d. 1,0 μL de cocktail d’inhibiteurs de protéase pour 1,0 mL de tampon BMB). Vortex le granulé pour assurer un mélange complet.
6. Ajouter 8,0 mL de dextran à 26 % dans chaque tube à centrifuger et vortex comme décrit aux étapes 4.1 à 4.2 du présent protocole.
7. Centrifuger des échantillons à 5 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
8. À l’aide d’une fiole isotherme et d’une pipette en verre, aspirez le surnageant et assurez-vous que la pastille contenant le microvaisseau cérébral n’est pas perturbée.
   note: L’excès de matériau qui a adhéré à la paroi du tube ne contient pas de microvaisseaux et doit être soigneusement nettoyé et retiré.
9. Répétez les étapes 4.5 à 4.8 deux fois de plus.
10. Une fois les 4 étapes de centrifugation au dextran terminées, ajoutez 5,0 mL de BMB à chaque pastille et vortex pour remettre l’échantillon en suspension.
    note: Une fois l’étape 4.10 terminée, des microvaisseaux entiers peuvent être collectés pour l’analyse de la localisation des protéines. Pour ce faire, il suffit de prélever une aliquote de 50 μL de pastilles de microrécipients remises en suspension et de l’étaler sur une lame de microscope en verre. Les microrécipients sont ensuite fixés thermiquement à 95 °C pendant 10 min sur un bloc chauffant, puis fixés dans de l’éthanol glacé pendant 10 minutes supplémentaires. Les lames peuvent ensuite être stockées à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires pour des études d’imagerie.

Résultats

Graphique 1 : Aperçu des procédures et des protocoles pour isoler les microvaisseaux du cerveau du rat et préparer des échantillons de membrane

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich	#P8340	Composant du tampon des microvaisseaux cérébraux
D-mannitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Composant du tampon des microvaisseaux cérébraux
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Composant du tampon des microvaisseaux cérébraux
Base Trizma	Sigma-Aldrich	#T1503	Composant du tampon des microvaisseaux cérébraux
Dextran (MW 75 000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Le dextran utilisé dans les étapes de centrifugation pour séparer les microvaisseaux du parenchyme cérébral
Zétamine	MWI Santé animale	#501072	Anesthésie générale
Xylazine	Approvisionnement médical occidental	Réf. 5530	Anesthésie générale
Solution saline à 0,9 %	Approvisionnement médical occidental	n/a	Diluant anesthésique général
Papier filtre (12,5 cm de diamètre)	VWR	#28320-100	Utilisé pour l’élimination des méninges du tissu cérébral
Tubes à centrifuger	Sarstedt	#60.540.386	Tubes jetables utilisés pour les étapes de centrifugation du dextran
Dosage de Pierce™ Coomassie Plus (Bradford)	ThermoFisher Scientific	Réf. 23236	Mesure de la concentration en protéines dans les préparations membranaires
Homogénéisateur aérien Wheaton	DWK Sciences de la vie	#903475	Nécessaire à l’homogénéisation des échantillons
Broyeur de mouchoirs en papier et pilon en verre de 10,0 ml	DWK Sciences de la vie	#358039	Nécessaire à l’homogénéisation des échantillons
acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich	#H1758	Nécessaire pour l’ajustement du pH des tampons
Pinces standard	Outils scientifiques fins	Référence 91100-12	Utilisé pour la dissection du tissu cérébral
Friedman-Pearson Rongeurs	Outils scientifiques fins	#16020-14	Utilisé pour ouvrir le crâne afin d’isoler le cerveau
Tubes à centrifuger coniques de 50 ml	ThermoFisher Scientific	Réf. 352070	Utilisé pour le prélèvement de tissu cérébral après isolement
Pipettes Pasteur en verre	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Utilisé pour l’aspiration de débris cellulaires suite à des spins de dextran
Éthanol anhydre	Sigma-Aldrich	#459836	Utilisé pour le nettoyage du broyeur de mouchoirs ; dilué à 70 % avec de l’eau distillée
kétamine
Seau à glace