Génération de neurones pyramidaux corticaux à partir de cellules souches neurales humaines

Résumé

Source : Gouder, L., et al,. Quantification tridimensionnelle des épines dendritiques des neurones pyramidaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo décrit une méthode de préparation de lamelles en verre recouvertes de polyornithine et de laminine pour améliorer l’adhésion et la croissance des cellules souches neurales. La technique implique des incubations et des lavages séquentiels, facilitant la formation d’une matrice de soutien qui favorise la croissance et la différenciation des cellules neuronales, imitant les structures présentes dans les neurones.

Protocole

1. Culture neuronale
   note: La reprogrammation des fibroblastes dans les cellules souches pluripotentes, l’engagement dans la lignée du télencéphale dorsal, la dérivation, l’amplification et la mise en banque de progéniteurs corticaux tardifs (LCP) ont été décrits dans Boissart et al. La différenciation neuronale des cellules de type LCP a également été réalisée selon Boissart et al avec de légères modifications. D’autres procédures ont été développées pour la reprogrammation directe des fibroblastes en cellules souches pluripotentes induites, suivie de leur différenciation en neurones. Ce protocole a été retenu puisqu’il permet la production sélective de neurones glutamatergiques pyramidaux.
   1. Traiter les plaques de culture à 6 puits avec des lamelles de verre avec de la poly-ornithine (diluée à 1/6 dans du DPBS (Dulbecco s Phosphate Buffered Saline), concentration de base 0,01 %) O/N, suivie de trois lavages dans DPBS. Ajouter ensuite de la laminine (concentration de matière première 1 mg/ml, diluée 500 fois dans du DPBS) pendant au moins 10 heures sous la hotte.
   2. Plaquer et expédier la NSC à faible densité (50 000 cellules/cm²) dans des plaques de culture à 6 puits avec lamelles en verre dans 3 ml de milieu de culture composé de DMEM (milieu d’aigle modifié de Dulbecco)/F12 (500 ml), 2 flacons (5 ml chacun) de supplément N2, 2 flacons (10 ml chacun) de supplément B27, 10 ml de Pen-Streptomycine (pénicilline = 10 000 unités/ml et streptomycine = 10 000 unités/ml), 1 ml de 2-mercaptoéthanol (solution mère : 50 mM) et de laminine (1/500), sans facteurs de croissance. ÉTAPE CRITIQUE : Effectuez cette étape avec précaution en ajoutant des cellules avec des mouvements de rotation lents pour réduire l’agrégation de cellules.
   3. Retirez le milieu de culture. Ajouter un milieu N2B27 frais contenant 2 μg/ml de solution de laminine fraîche pour maintenir le neurone attaché aux lamelles de verre et éviter l’agglutination. Changez de support tous les 3 jours. Conservez une partie du milieu restant (200 μl) avant d’ajouter du milieu frais pour éviter que la cellule ne sèche. Vous pouvez également procéder rapidement et modifier le volume total (3 ml).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
-PBS (1X), sans Calcium, Magnésium et Rouge de Phénol	Gibco/ Life Technologies	14190169
Bioréactif en solution de poly-L-Ornithine	Sigma Aldrich	Réf. P4957
Laminine de souris	Dutscher Dominique	354232
Supplément N2	Gibco/ Life Technologies	17502048
B-27 Supplément sans vitamine A (50X)	Gibco/ Life Technologies	12587010
DMEM/ÉCROU. MIX F-12 avec GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-mercaptoéthanol	Gibco/ Life Technologies	Référence 31350-010
Pen-Steptomycine	Gibco/ Life Technologies	Référence 15140-122
Verre de protection 13 mm	VWR	Référence 631-0150
Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPI	Gibco/ Life Technologies	Réf. P36931
Tween(R) 20 Bioextra, liquide visqueux	Sigma Aldrich Chimie	Réf. P7949
Fibroblastes humains	Biobanque de lignées cellulaires de Coriell	GM 4603 et GM 1869	Institut Coriell de recherche médicale, Camden, NJ, États-Unis
Incubateur à CO2
6 plaques de culture à puits
Piptette