Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation et ablation du cerveau de la souris pour le tranchage
- Préparer la perfusion et l’incubation en tranches.
- Environ 30 minutes avant le tranchage, préparer une solution de bouturage à haute teneur en saccharose et du liquide céphalorachidien artificiel à faible teneur en calcium (LCR) pour l’incubation de la tranche avant l’enregistrement ou l’imagerie.
- Disposez tous les outils nécessaires (gros ciseaux à bout émoussé, petits ciseaux à ressort, pince anatomique, grands ciseaux ou guillotine, ciseaux à iris, pinces de bijoutier, seringue de 10 ml avec aiguille de 27G x 1/2 pouce, petit morceau de papier filtre de 1 cm x 2 cm et une pipette Pasteur à pointe cassée pour le transfert de tranches) pour la perfusion et le tranchage, et préparer le plateau de perfusion.
- Mettre en place une chambre d’incubation avec de l’aCSF oxygéné dans un bain-marie à 32 °C et une boîte de culture remplie de solution de bouturage.
- Préparez l’étape de coupe pour le tranchage.
- Coupez un petit morceau de gélose à 3 % d’environ 1 cm3 pour l’utiliser comme filet de sécurité pour le cerveau et 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm pour une bosse à utiliser pour soutenir le colliculus inférieur (CI).
- Collez la butée arrière sur la scène avec de l’adhésif cyanoacrylate ainsi que la bosse sur le côté droit de la butée arrière de manière à ce qu’elles forment un angle de 80o.
- Retirez le cerveau.
- Anesthésie profonde d’une souris postnatale du 12e au 20e jour postnatal (p12-p20, idéalement p14-18) avec de la kétamine 100 mg/kg et de la xylaxine 3 mg/kg (ou une procédure comparable approuvée par le comité d’éthique).
note: Confirmez le niveau d’anesthésie approprié par l’absence de réponse au pincement des orteils. Comme l’animal est sous anesthésie brièvement, la pommade ophtalmique n’est pas nécessaire.
- À l’aide de ciseaux à extrémité émoussée, exposez la cage thoracique de l’apophyse xiphoïde au cou.
- Trouvez le processus xiphoïde et faites une coupe horizontale d’environ 1,5 cm.
- Faites deux coupes verticales entre les extrémités de la coupe horizontale précédente et les épaules, d’environ 1,5 cm chacune.
- Coupez à travers le diaphragme et les jonctions costochondrales pour exposer le cœur.
- À l’aide de petits ciseaux à ressort, faites une petite incision de 2 à 5 mm dans l’oreillette droite, de la face ventrale à la face dorsale du cœur.
- À l’aide d’une seringue de 10 ml munie d’une aiguille de 27 g x 1/2 pouce, injectez le ventricule gauche et perfrez rapidement l’animal avec une solution de coupe à haute teneur en saccharose.
- Une fois que le sang s’écoule, utilisez des ciseaux plus grands pour retirer la tête.
note: Nous n’avons pas systématiquement évalué l’utilité de la perfusion. Cependant, d’après notre expérience, la perfusion transcardiaque chez des souris aussi jeunes peut être effectuée avec près de 100 % de succès et a l’avantage d’éliminer les globules rouges, qui peuvent devenir fluorescents et interférer avec l’imagerie.
- Coupez la peau le long de la ligne médiane pour exposer le crâne.
- À l’aide de ciseaux à iris pliés, coupez le crâne entre les yeux, puis en commençant par la coupe entre les yeux, coupez soigneusement de l’avant vers l’arrière le long de la suture médiane en prenant soin de ne pas endommager le cerveau en dessous.
note: La dure-mère se détache généralement avec le crâne. Si nécessaire, retirez la dure-mère avant de retirer soigneusement le cerveau.
- À l’aide d’une pince de bijoutier, ouvrez le crâne et retirez soigneusement le cerveau, puis placez le cerveau dans une solution de coupe. Prenez soin de ne pas endommager les cortex.
2. Préparer le cerveau au découpage
- Préparation du cerveau pour le montage sur la platine du vibratome.
- À l’aide d’une lame marquée de deux lignes à 90° et d’une ligne diagonale à 17° du haut à gauche vers le bas à droite, en coupant l’endroit où les deux lignes se rencontrent, placez le cerveau côté dorsal vers le haut, à l’aide d’une lame de rasoir, retirez 2 à 4 mm de l’extrémité rostrale du cerveau en créant une surface plane.
- Placez le côté caudal du cerveau vers le haut sur la surface plane nouvellement créée et alignez la surface dorsale du cerveau avec la ligne horizontale et la ligne médiane du cerveau avec la ligne verticale.
- Alignez la lame du rasoir avec la ligne 17o, inclinez le rasoir à un angle de 30o et retirez environ 3 mm du cortex droit dans une double coupe diagonale (17o du plan horizontal et 60o du plan coronal).
- Cerveau en montée sur la scène du vibratome.
- Placez un petit morceau de papier filtre de 1 cm x 2 cm sur la face ventrale du cerveau de manière à ce que la dimension longue soit perpendiculaire à la ligne médiane.
- Appliquez soigneusement une petite quantité d’adhésif cyanoacrylate sur la zone située devant la butée arrière (et à gauche de la bosse).
- Placez le double visage du cerveau coupé en diagonale sur la colle de sorte que la partie caudale du cerveau et le cerveau postérieur soient appuyés sur la bosse et que le côté droit du cerveau soit contre le butoir.
- Appuyez délicatement sur le cerveau, en vous assurant que toute la surface est en contact avec la chambre de tranchage.
3. Obtention de la tranche colliculo-thalamocorticale
- Prenez rapidement l’étape de coupe et placez-la dans le vibratome, remplissez l’étape de solution de coupe.
- Alignez la lame avec le haut (face ventrale) du cerveau.
- Retirez 1 à 1,5 mm du haut du cerveau, retirez des tranches de 300 à 500 μm et évaluez la profondeur après le retrait.
Remarque : Lorsque l'IC, le corps géniculé médial (MGB) et le noyau géniculé latéral (LGN) sont tous visibles, et que le gyrus denté forme une forme en « C », prenez une à deux tranches de 600 μm. Voir la figure 1A.
- Placer les tranches dans la chambre de conservation chauffée (32 °C).
