$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Préparation de plaques revêtues de matrice extracellulaire (ECM)
- Diluer l’ECM (voir tableau des matériaux) avec de la glace 1x PBS jusqu’à une concentration finale de 2 %
- Ajoutez 1 ml d’ECM à 49 ml de 1x PBS dans un tube en plastique de 50 ml. Bien mélanger en pipetant plusieurs fois de haut en bas.
- Placez 1 lamelle dans chaque puits d’une assiette à 6 puits. Ajouter 1,5 mL de MEC à 2 % dans chaque puits.
- Incuber la plaque du puits avec 2 % ECM pendant 2 h à 37 °C.
- Aspirez l’ECM de la plaque du puits et stockez-la à 4 °C avant utilisation.
2. Différenciation des iPSC vers la NMJ
- Semez 4 x 105 d’iPSC par puits sur la plaque à 6 puits préparée à la section 1. Assurez-vous d’ensemencer les cellules sur la lamelle pré-déposée dans le puits.
note: Dans cette étude, la lignée cellulaire 201B7MYOD iPS a été utilisée.
- Retirez le milieu des iPSC sur la boîte de culture de 6 cm et lavez les iPSC une fois avec 1x PBS.
- Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire dans la boîte et incuber pendant 10 min à 37 °C.
- Ajoutez 3 ml de milieu de cellules souches embryonnaires de primate dans la boîte et pipetez doucement 3 fois.
- Prélever le surnageant, qui contient des iPSC détachés, dans un tube en plastique de 50 mL et centrifuger à 160 x g à 4 °C pendant 5 min.
- Aspirez soigneusement le surnageant, remettez les iPSC en suspension dans un milieu cellulaire ES de primate de 3 mL avec 10 μM Y27632, et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Diluer les iPSC avec un milieu cellulaire ES de primate et 10 μM Y27632 à une concentration de 2 x 105 cellules/mL. Ajouter 2 mL de CSPi sur la lamelle prédéposée dans le puits décrit à la section 1.
3. Induction des iPSC à la JNM
- Le jour 1, 24 h après l’ensemencement des CSPi dans la plaque à 6 puits, retirer le milieu de culture et le remplacer par 2 mL de milieu cellulaire ES de primate frais contenant 1 μg/mL de doxycycline dans chaque puits.
- Changer le milieu avec 2 mL de milieu de différenciation myogénique (MDM) (tableau 1) contenant 1 μg/mL de doxycycline (concentration finale) dans chaque puits. Rafraîchissez le support tous les jours du jour 2 au jour 10.
- À partir du 11e jour, remplacer le milieu par 2 mL de milieu NMJ (tableau 1) dans chaque puits. Rafraîchissez le support tous les 3 à 4 jours par la suite jusqu’au 30e jour.
- Observez la NMJ différenciée par microscopie à inversion de phase le 30e jour. Le NMJ peut être utilisé pour l’analyse suivante.