Technique de prélèvement et de dissociation des ganglions de la racine dorsale pour les cultures neuronales

Résumé

Source : de Luca, A. C., et al., Neurones des ganglions de la racine dorsale et cellules souches dérivées du tissu adipeux différenciés : un modèle de co-culture in vitro pour étudier la régénération des nerfs périphériques. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo présente une méthode de prélèvement de neurones dans les ganglions de la racine dorsale (DRG). Les DRG de la colonne vertébrale d'un rat sont isolés, traités avec des enzymes, puis dissociés mécaniquement pour obtenir une suspension unicellulaire. Les neurones sont séparés des cellules gliales par centrifugation à gradient de densité et cultivés dans un milieu de croissance.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Dispositif expérimental

1. Avant de commencer le prélèvement de tissus et de cellules, vérifiez que tous les outils sont stériles. Si nécessaire, autoclavez une paire de ciseaux chirurgicaux tranchants, une paire de pinces très fines et une paire de pinces standard fines. De plus, le cas échéant, stérilisez chaque substrat avant l’ensemencement cellulaire en utilisant la stérilisation aux UV, l’exposition à l’éthanol ou la stérilisation à la vapeur.
2. Préparation de milieu....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Crépine de cellules de 100 μm	BD Biosciences	Référence 352360	Des crépines de 70 μm (réf. 352350) peuvent être utilisées comme alternative
Tubes en plastique de 15 mL	Sarstedt	Référence 62.554.002
Tubes en plastique de 50 mL	Sarstedt	Référence 62.547.004
75 cm2 flacons	Corning	BC301
Albumine sérique bovine (BSA)	sigma	A9205
Collagénase de type IV	Biochimique Worthington	LS004188	Attention : cette collagénase n’est utilisée que pour dissocier les explants de DRG
Sérum fœtal bovin (FBS)	Biosérums	FB-1001
Pipettes en verre	Fisher Scientific	FB50253	Matériau tranchant à éliminer en conséquence
Mélange de nutriments F12 HAM	sigma	N° N6658	Réchauffer à 37 °C dans un bain-marie, sauf indication contraire
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	sigma	N° H9394	Réchauffer à 37 °C dans un bain-marie, sauf indication contraire
Supplément N-2 (100x)	Invitrogen	Référence 17502
Protéine du facteur de croissance nerveuse 2,5s, glandes sous-maxillaires de souris (NGF)	Millipore	Réf. NC011
Pénicilline-streptomycine (PS)	sigma	Réf. P0781
Pétri	Corning	430165
Trypsine (2x pancréas bovin)	Biochimique Worthington	LS003703	Ceci est utilisé pour la dissociation DRG