Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Dispositif expérimental
- Avant de commencer le prélèvement de tissus et de cellules, vérifiez que tous les outils sont stériles. Si nécessaire, autoclavez une paire de ciseaux chirurgicaux tranchants, une paire de pinces très fines et une paire de pinces standard fines. De plus, le cas échéant, stérilisez chaque substrat avant l’ensemencement cellulaire en utilisant la stérilisation aux UV, l’exposition à l’éthanol ou la stérilisation à la vapeur.
- Préparation de milieux et de solutions mères pour la récolte et la dissociation des neurones
- Préparez le milieu Bottenstein et Sato (BS) en ajoutant 1 % de pénicilline-streptomycine (PS) et 1 % de supplément de N2 au milieu F12 de Ham. Calculez le volume final nécessaire à 500 μl par puits (si vous utilisez une plaque à 24 puits).
- Préparez les stocks de collagénase IV dans le milieu F12 de Ham à la concentration de 1,25 % en poids/v. Filtrez et stérilisez la solution et conservez-la à -20 °C sous forme de 200 μl d'aliquotes.
- Préparer des stocks de trypsine pancréatique bovine dans le milieu F12 de Ham à une concentration de 2,5 % en poids/v, stériliser par filtration et stocker à -20 °C sous forme de 200 μl d'aliquotes.
- Préparer la solution mère de facteur de croissance nerveuse (NGF) à la concentration de 5 μg/mL dans une solution d’albumine sérique bovine (BSA) exempte d’acides gras stérilisée par filtre dans un milieu F12 et conserver à -20 °C sous forme de 200 μl d’aliquotes. Ne filtrez pas le NGF après reconstitution.
- Dans le cas où aucune modification de surface n’a été effectuée, enduire les lamelles/plaques de poly-D-lysine (0,1 mg/ml pendant 15 min à température ambiante [RT]) et/ou de laminine (2-10 μg/cm2 pendant 2 h à 37 °C) pour favoriser l’attachement des neurones et la croissance des neurites, le cas échéant.
- Réchauffez toujours le support dans un bain-marie à 37 °C avant de l’utiliser.
2. Récolte et dissociation des neurones des ganglions de la racine dorsale (DRG)
- Éliminer le rat par luxation cervicale et décapitation. Rasez le rat et soulevez la peau pour exposer la colonne vertébrale. À l’aide de ciseaux tranchants, excisez la colonne vertébrale en prenant soin des organes et des vaisseaux sanguins confinés. Transférez la colonne vertébrale dans une enceinte de sécurité biologique (classe II) à l’aide d’une boîte de Pétri et retirez toute partie dorsale.
- Divisez la colonne vertébrale en deux le long de l’axe longitudinal à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles et tranchants pour exposer le tissu du cordon. À ce stade, il est utile de couper la colonne vertébrale en deux segments plus petits sous le niveau de la cage thoracique, pour la rendre plus facile à manipuler lors de la récolte des neurones DRG. À l’aide d’une pince fine, retirez délicatement tout le tissu du cordon, en faisant attention de ne pas tirer et retirer les racines DRG. De cette façon, le DRG et les racines seront exposés dans les canaux vertébraux, toujours enfermés dans la colonne. Observez les DRG comme des filaments blancs sortant directement des canaux.
- Retirez toute la racine du DRG (pas seulement le DRG) des canaux vertébraux à l’aide de pinces très fines, en pénétrant profondément dans les canaux vertébraux et en faisant attention à ne pas endommager les racines des ganglions. Transvasez le DRG dans une petite boîte de Pétri (60 mm2) contenant 3-4 ml de milieu F12 de Ham complété par 1 % de PS. Si vous utilisez différents animaux, utilisez des plats séparés.
- À l’aide d’un microscope à dissection, nettoyez le DRG de tout excès de racines nerveuses entourant les ganglions à l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel pour réduire la contamination des cellules gliales. Transvasez le DRG dans une petite boîte de Pétri (35 mm2) avec 1,8 ml de milieu F12 frais.
- Ajouter 200 μl de solution mère de collagénase de type IV à 1,25 % en poids/v (concentration finale de 0,125 %) et incuber le DRG à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 1 h. Aspirer soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette en verre, en faisant attention à ne pas aspirer ou endommager le DRG. Ajouter du milieu F12 frais complété par 0,125 % en poids / v de l’enzyme collagénase de type IV et incuber pendant 1 heure comme décrit précédemment.
- Aspirez le fluide et lavez délicatement le DRG avec le fluide F12. Ajouter ensuite 1,8 ml de milieu F12 et 200 μl de trypsine (concentration finale de 0,25 % poids/v) et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 30 min.
- Retirer la trypsine et ajouter 1 ml de milieu F12 complété par 500 μl de sérum fœtal bovin (FBS) pour arrêter la réaction enzymatique. Aspirez le milieu et lavez doucement le DRG avec le milieu F12 pendant trois fois pour éliminer les traces de sérum.
- Ajoutez 2 ml de milieu F12 frais et transférez soigneusement le DRG avec le milieu dans un tube de 15 ml à l’aide d’une pipette en verre. Dissociez doucement les neurones DRG en pipetant de haut en bas (environ 8 à 10 fois) avec la pipette en verre (des pointes en plastique peuvent être utilisées comme alternative).
- Laissez la pastille se déposer au fond du tube et récupérez le fluide dans un nouveau tube. Ajoutez 2 ml de milieu F12 frais dans le tube contenant la pastille et répétez la dissociation mécanique avec la pipette en verre. Répétez cette étape jusqu’à ce que la suspension devienne homogène (environ 3-4 fois) et récupérez tous les DRG dissociés dans le nouveau tube. Cette méthode réduit le stress dérivé de la dissociation mécanique et améliore la viabilité des neurones.
- Filtrez la suspension homogénéisée résultante dans un nouveau tube de 15 ml à l’aide d’une crépine cellulaire de 100 μm pour éliminer les neurones non dissociés et autres débris. À ce stade, il peut être pratique de filtrer d’abord la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml, puis de transférer la solution dans le tube plus petit à l’aide d’une pipette en verre. Centrifuger la suspension à 110 g pendant 5 min.
- Préparez un BSA à 15 % en ajoutant 500 μl d’une solution BSA à 30 % à 500 μl de milieu F12. Pipetez lentement la solution le long de la paroi d’un tube de 15 ml pour créer un sillage protéique progressif. À ce stade, il est utile de tenir le tube à un angle de 45° et de libérer lentement le BSA en utilisant les chiffres sur le tube de faucon comme référence pour la « piste » de formation.
- Aspirez le surnageant à partir de l’étape 2.10 en laissant 500 μl au fond du tube et remettez en suspension la pastille cellulaire dans le même milieu. Pipetez lentement la suspension le long de la piste protéique préalablement préparée à l’étape 2.11 (utilisez les chiffres sur le tube comme référence) et centrifugez à 500 g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 ml de milieu BS modifié.
note: Le volume nécessaire pour remettre en suspension les neurones DRG peut être porté au volume réel requis, en fonction de la concentration cellulaire finale souhaitée et du nombre d’échantillons à ensemencer. Un animal fournira suffisamment de cellules pour une expérience sur plaque de 24 puits.
- Incuber les échantillons ensemencés à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 2 heures pour permettre la fixation des cellules et enfin ajouter du milieu BS frais complété par 50 ng/ml de NGF.
