Amélioration de la différenciation des cellules souches avec un traitement transitoire au DMSO

Résumé

Source : Sambo, D. et al., Traitement transitoire de cellules souches pluripotentes humaines avec du DMSO pour promouvoir la différenciation. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la méthode d’amélioration de la différenciation des cellules souches avec un traitement transitoire au DMSO, qui arrête les cellules en phase G1. Après le traitement, un milieu de différenciation ectodermique avec des inhibiteurs de BMP et de TGF-β est ajouté pour favoriser la formation de précurseurs neuraux.

Protocole

1. Maintenance des cellules souches

REMARQUE : Le protocole de maintenance cellulaire décrit ci-dessous s’applique aux cellules souches pluripotentes (CSP) maintenues dans une monocouche adhérente. Les milieux, les autres réactifs et les plaques de culture cellulaire utilisés avant le traitement au diméthylsulfoxyde (DMSO) peuvent être ajustés au besoin. Pour tous les protocoles suivants dans ce manuscrit, les cellules doivent être manipulées sous une enceinte de sécurité biologique.

1. Enrober des plaques stériles, à 6 puits, traitées pour la culture tissulaire d'une matrice ou d'un substrat qualifié de cellules souches pluripotentes préparé selon les instructions du fabricant et incuber pendant au moins 1 h dans un incubateur de CO₂ (5 % de CO₂, atmosphère humide). Les plaques revêtues peuvent être filmées et stockées à 4 °C pendant une semaine maximum.
2. Décongelez les CSP cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C. Stériliser le flacon avec de l’éthanol avant de l’introduire dans l’enceinte de sécurité biologique, puis transférer immédiatement les cellules par pipetage dans un tube conique stérile contenant 5 à 10 volumes de cellules souches préchauffées.
3. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
4. Aspirez le milieu et remettez doucement la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu de cellules souches complété par un inhibiteur de la protéine kinase associée à la rho (ROCK) de 10 μM, tel que le Y-27632.
5. Aspirez la matrice de culture de la plaque et ensemencez les cellules à la densité souhaitée, généralement 0,5-1 x 10⁶ cellules par puits dans au moins 2 mL de milieu de cellules souches par puits.
   note: La densité de placage peut varier entre différentes lignées cellulaires et clones et doit être optimisée en conséquence.
6. Entretenez les cellules en les remplaçant quotidiennement par des milieux de cellules souches préchauffés. Divisez les cellules à environ 70 % à 80 % de confluence ou lorsque les colonies cellulaires commencent à entrer en contact.
7. Pour diviser les cellules, aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile. Incuber les cellules avec 1 mL d’une solution d’enzyme de dissociation par puits pendant 5 à 10 minutes à 37 °C.
8. Lavez et mettez en suspension les cellules avec un milieu de cellules souches préchauffé et transférez-les dans un tube conique stérile contenant 5 à 10 volumes de cellules souches. Suivez les étapes 1.3 à 1.7 pour plaquer les cellules.

2. Prétraitement DMSO

REMARQUE : Lors du placage des cellules pour le prétraitement du DMSO avant la différenciation, la densité cellulaire de départ doit être optimisée en tenant compte du taux de croissance typique de la lignée de cellules souches ainsi que du protocole de différenciation utilisé. Validez la pluripotence à l’aide de marqueurs conventionnels, si nécessaire. Les cellules doivent être passées au moins 1x-2x après la décongélation initiale avant la différenciation.

1. Différenciation culturelle 2D
   1. Lorsque les cellules atteignent une confluence appropriée, préparez des plaques enrobées, dissociez les cellules et préparez une suspension unicellulaire comme décrit ci-dessus.
   2. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules, y compris le bleu trypan ou un autre marqueur de viabilité.
   3. Plaquez les cellules sur une plaque à 6 puits enduite à 0,5-1 x 10⁶ cellules par puits dans un milieu de cellules souches avec l’inhibiteur ROCK de 10 μM.
      REMARQUE : Pour les lignées cellulaires testées dans notre laboratoire, ces densités ont généralement donné lieu à des cellules confluentes de 80 % à 90 % au cours du prétraitement DMSO de 24 heures.
   4. Laisser les cellules incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur de CO₂ (5 % de CO₂, atmosphère humide).
   5. Préparez 1 % à 2 % de DMSO dans un milieu de cellules souches préchauffé (p. ex. 100 μL de DMSO dans 10 ml de milieu = solution de DMSO à 1 %, ou 200 μL de DMSO dans 10 ml de milieu = solution de DMSO à 2 %).
   6. Après 24 h d’incubation, aspirez le milieu des cellules et remplacez-le par une solution de DMSO.
   7. Laisser les cellules incuber pendant 24 h à 48 h à 37 °C dans un incubateur de CO₂ (5 % de CO₂, atmosphère humide) avant la différenciation.
      REMARQUE : En règle générale, un traitement DMSO de 24 heures est suffisant pour la majorité des lignées d’embryons humains et de cellules souches pluripotentes induites (ESC et iPSC). Les lignées cellulaires ayant des taux de croissance très lents (longs temps de doublement) peuvent bénéficier de l’incubation de 48 heures avec le DMSO. Pour une incubation de 48 h avec du DMSO, le milieu peut être remplacé par un milieu de cellules souches fraîches contenant 1 % à 2 % de DMSO après les 24 premières heures de traitement.

3. Différenciation en couches germinales primaires

NOTE : Ce qui suit décrit les méthodes dont l’efficacité a été précédemment démontrée dans notre laboratoire pour les CSP cultivées en monocouche sur des plaques à 6 puits. Tout protocole de différenciation de choix doit être utilisé après le traitement au DMSO pour favoriser la différenciation en lignées souhaitées. Retirer la solution de DMSO après un traitement de 24 à 48 heures et procéder à la différenciation en suivant les protocoles standard.

1. Différenciation de l’ectoderme
   1. Prétraiter les cellules avec du DMSO comme décrit ci-dessus pour les cultures 2D.
   2. Préparez les solutions mères Noggin et SB431542.
   3. Préparez un milieu de base de différenciation ectodermique en dissolvant le sérum de remplacement (KOSR) à une concentration finale de 10 % dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM).
      note: Préparez suffisamment de support de base pour 3-4 jours de changement de support.
   4. Préparez le milieu de différenciation ectodermique en ajoutant Noggin à une concentration finale de 500 ng/mL et SB431542 à une concentration finale de 10 μM au volume approprié de KOSR/DMEM knockout préchauffé.
   5. Après le prétraitement au DMSO, aspirer les milieux des cellules et les remplacer par des milieux de différenciation (p. ex., 2 mL par puits d’une plaque à 6 puits).
   6. Laisser les cellules incuber pendant 3 à 4 jours à 37 °C dans un incubateur de CO₂ (5 % de CO₂, atmosphère humide), en remplaçant quotidiennement le milieu par des facteurs de différenciation fraîchement ajoutés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture cellulaire multipuits à fond plat transparent à 6 puits traitée TC	Corning	353046
Compteur de cellules automatisé Countess II FL	Thermo Fisher Scientific	AMQAF1000
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Dmso	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM KO	Gibco	10829018
Remplacement du sérum knockout	Gibco	10828028
Matrice Matrigel	Corning	354277
Protéine de chimère Noggin Fc	Systèmes de R&D	Référence 3344-NG-050
SB431542	Tige	Référence 04-0010
Microplaques à fixation ultra-faible	Corning	Référence 3471
Y-27632	Technologies StemCell	Référence 72302