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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation des tampons de dissection et des milieux de culture
- Pour l’isolement de la moelle épinière du rat, préparez un tampon de dissection de 100 ml (1x PBS + 0,6 % de glucose + 2 % de pénicilline-streptomycine) et réfrigérez.
- Préparez 100 ml de milieu sans sérum (SFM) et réchauffez-le à 37 °C. Pour préparer la SFM, ajoutez 2 mM de L-glutamine, 100 μg/ml de pénicilline-streptomycine, 2 % de B27 et 10 % de mélange d’hormones dans un milieu Neurobasal-A. Pour préparer un mélange d’hormones, préparez un milieu DMEM/F12 1:1 contenant 0,6 % de glucose, 3 mM de NaHCO3, 5 mM d’HEPES, 25 μg/ml d’insuline, 100 μg/ml d’apo-transferrine, 10 μM de putrescine, 30 nM de sélénium et 20 nM de progestérone.
- Préparez le milieu de placage enrichi en facteur de croissance EFH (ajoutez à SFM 20 ng/ml d’EGF, 20 ng/ml de bFGF et 2 μg/ml d’héparine) et réchauffez-le à 37 °C.
2. Prélèvement et dissection de tissu de la moelle épinière périventriculaire d’un rat adulte
- Stérilisez à l’avance les instruments de dissection à l’éthanol et rincez-les à l’avance avec une solution saline stérile ou des instruments d’autoclave. Administrer à des rats (âgés de 6 à 8 semaines) une injection létale de pentobarbital sodique (1 cc à 65 mg/ml) ou une surdose d’anesthésique (c.-à-d. 4 % d’isoflurane) selon le protocole animal approuvé par l’établissement. Arrosez le dos du rat avec de l’éthanol à 70 % et retirez la peau de la surface dorsale avec de grandes ciseaux de dissection.
- En tenant les ciseaux perpendiculairement à la surface dorsale, coupez transversalement la colonne vertébrale au-dessus des membres postérieurs. Utilisez des ciseaux plus petits pour couper longitudinalement le muscle dorsal recouvrant la colonne vertébrale dans une direction rostrale afin d’exposer les apophyses épineuses.
- En commençant par l’extrémité caudale exposée, insérez des rongeurs ou un petit instrument de coupe osseuse émoussé extraduralement dans la face latérale du canal rachidien dans l’espace entre la moelle épinière et la colonne vertébrale. Faites de petites incisions dans le limbe (arcs osseux à gauche et à droite des apophyses épineuses de chaque côté des vertèbres) et décollez soigneusement le limbe pour exposer la moelle épinière (figures 1A-D). Assurez-vous que l’angle des lames est peu profond et parallèle à la moelle épinière afin que la moelle épinière sous-jacente ne soit pas endommagée.
- Poursuivez la laminectomie dans le sens rostral pour exposer la moelle épinière thoracique et cervicale.
- Excise doucement la moelle épinière de la colonne vertébrale à l’aide d’une pince à tissu émoussé et utilise des microciseaux pour sectionner soigneusement les racines afin de libérer le cordon. Placez la moelle épinière excisée dans une boîte de Pétri contenant un tampon de dissection stérile pour rat à 4 °C (décrit ci-dessus en 1.1). Rincez le tissu dans un tampon de dissection à 4 °C fraîchement préparé et coupez la moelle épinière transversalement en segments de 1 cm à l’aide de ciseaux (Figure 1E).
- Pour chaque segment de tissu, utilisez une main pour tenir le tissu avec des pinces fines. De l’autre main, utilisez des microciseaux pour enlever soigneusement les méninges sus-jacentes, la substance blanche et la majeure partie de la matière grise à l’aide d’une lunette de dissection. Alternativement, utilisez des pinces fines (Dumont #4) pour enlever la majeure partie de la matière grise et blanche, ne laissant que la région périventriculaire de la moelle épinière qui comprend l’épendyme et une petite quantité de matière grise environnante (Figure 1F-H).
- Placez le tissu périventriculaire disséqué dans une boîte de Pétri stérile de 10 cm contenant un tampon de dissection de rat froid.
3. Isolement et élevage de NSPC de moelle épinière de rat adulte
- Effectuez les étapes suivantes de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire.
- Émincez le tissu périventriculaire du rat disséqué en morceaux de 1 mm à l’aide de microciseaux.
- Dissocier enzymatiquement le tissu haché avec des enzymes protéolytiques à l’aide du kit de dissociation de la papaïne comme indiqué dans le tableau des matériaux/réactifs.
note: Les composants du réactif comprennent quatre flacons : Flacon 1 : solution saline équilibrée d'Earle (EBSS). Flacon 2 : Papaïne contenant de la L-cystéine et de l’EDTA. Flacon 3 : Désoxyribonucléase I (DNase). Flacon 4 : Inhibiteur de la protéase ovomucoïde avec albumine sérique bovine (BSA).
REMARQUE : La papaïne est une protéase sulfhydryle avec une grande spécificité pour les substrats protéiques. La papaïne est dérivée du latex de la plante de papaye Carica et dégrade la plupart des substrats protéiques plus largement que les protéases pancréatiques. Au cours du processus de dissociation, certains dommages cellulaires provoquent la libération d’ADN dans le milieu de dissociation, ce qui augmentera la viscosité et rendra le pipetage difficile. Ainsi, la DNase est incluse dans la procédure d’isolement cellulaire pour digérer l’ADN sans endommager les cellules intactes. Les ovomucoïdes sont des inhibiteurs de la glycoprotéine protéase utilisés pour inhiber l’activité de la papaïne après l’étape de dissociation.
- Lors de la première utilisation, reconstituer le mélange d’inhibiteurs d’albumine ovomucoïde (flacon 4) avec 32 ml d’EBSS (flacon 1), puis conserver à 4 °C et l’utiliser pour les isolements ultérieurs. note: Cela donne une solution à une concentration efficace de 10 mg d’inhibiteur ovomucoïde et de 10 mg d’albumine par ml.
- Ajouter 5 ml d’EBSS (flacon 1) dans le flacon de papaïne (flacon 2), ce qui permet d’obtenir une solution à raison de 20 unités de papaïne/ml dans 1 mM de L-cystéine avec 0,5 mM d’EDTA. Vérifiez que la solution de papaïne semble claire lorsqu’elle est complètement dissoute. Sinon, placez le flacon dans un bain-marie à 37 °C pendant dix minutes jusqu’à ce que la papaïne soit complètement dissoute pour assurer l’activité totale de l’enzyme.
- Ajouter 500 μl d’EBSS (flacon 1) dans le flacon de DNase (flacon 3) et mélanger doucement car la DNase est sensible à la dénaturation par cisaillement. Ajouter 250 μl de la solution de DNase dans le flacon de papaïne, ce qui permet d’obtenir une concentration finale d’environ 20 unités/ml de papaïne et 0,005 % de DNase. Enregistrez la DNAse restante pour une utilisation ultérieure.
- Placez le tissu de rat haché dans la solution de papaïne.
- Incuber à 37 °C avec une agitation constante sur une plate-forme à bascule pour dissocier le tissu dans la solution de papaïne activée. Incuber du tissu de rat pendant 45 min à 1 h.
- Triturez le mélange avec une pipette de 10 ml pour dissocier les morceaux de tissu restants et obtenir une suspension de cellules troubles. Transvaser la suspension cellulaire (ne pas inclure de morceaux de tissu non dissocié) dans un tube conique stérile de 15 ml et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à RT.
- Remettez en suspension les cellules granulées dans un milieu contenant de l’ovomucoïde, un inhibiteur de la papaïne.
- Préparez la solution d’ovomucoïde en mélangeant 2,7 ml d’EBSS (flacon 1) avec 300 μl de solution d’inhibiteur d’albumine-ovomucoïde reconstituée (flacon 4) dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 150 μl de solution de DNase (flacon 3).
- Jetez le surnageant des cellules granulées et remettez immédiatement en suspension la pastille cellulaire dans le mélange dilué d’inhibiteur d’albumine DNase.
- Séparez les cellules intactes des membranes cellulaires par centrifugation à travers un gradient de densité discontinu en une seule étape.
- Préparez le gradient de densité discontinu en ajoutant 5 ml de solution d’inhibiteur d’albumine (flacon 4) dans un tube de 15 ml et, à l’aide d’une pipette de 5 ml, superposez doucement et lentement la suspension cellulaire (préparée comme décrit ci-dessus) sur la solution d’inhibiteur d’albumine.
- Centrifugeuse à 70 x g pendant 6 min à RT.
note: L’interface entre les deux couches du dégradé doit être clairement visible, bien qu’un mélange minimal à cette limite n’affecte pas le résultat. Les fragments de membrane restent à l’interface et les cellules dissociées s’agglomérent au fond du tube.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 ml de milieu EFH pour rat (préchauffé à 37 °C). Comptez la densité des cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre et placez les cellules dans un flacon de culture T25 à une densité de 10 cellules/μl en EFH. Le rendement typique de cellules à partir de tissu de rat est d’environ 2 x 106 cellules avec une viabilité d’environ 80 %. Si des cultures clonales sont souhaitées, ensemencer des cellules à une densité inférieure à 10 cellules/μl. Incuber les flacons à 37 °C dans 5 % de CO2 et laisser les cultures pousser sans être dérangées pendant 1 semaine pour éviter l’agrégation de sphères.
