Isolement et culture de péricytes cérébraux de souris

Résumé

Source : Mehra, A., et al., Une méthode à haut rendement pour isoler les péricytes cérébraux de la souris. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre une méthode pour isoler les péricytes cérébraux du cerveau d’une souris. Les cellules isolées sont cultivées dans des milieux spécifiques aux péricytes pour favoriser la prolifération des péricytes.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation des solutions

1. Préparez 500 mL de tampon de lavage A (WBA) : 10 mM de solution HEPES dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Conserver à 4 °C.
2. Préparez 500 mL de tampon de lavage B (WBB) : 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) avec 10 mM de solution HEPES dans HBSS. Conserver à 4 °C.
3. Préparez 300 ml de solution de dextran à 30 % dans du WBA en mélangeant la solution pendant la nuit à température ambiante. Autoclavez la solution à 110 °C pendant 30 min avant utilisation. Après l’autoclavage, laissez reposer la solution à température ambiante pendant 2-3 h. Conserver la solution à 4 °C.
4. Préparez 100 mL de solution de BSA à 0,1 % dans une solution froide de dextran. Agiter vigoureusement pendant 3-4 min et conserver à 4 °C.
5. Préparez un milieu de culture complet de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en dissolvant 20 % de sérum de veau, 2 mM de glutamine, 50 μg/mL de gentamycine, 1 % de vitamines, 2 % d'acides aminés Basal Medium Eagle (BME) dans un milieu DMEM basal et conservez-le à 4 °C. Ajoutez 1 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) avant l'utilisation.
6. Préparez un milieu péricytaire complet en ajoutant des suppléments de croissance de péricytes (fournis avec le milieu péricytaire) et 20 % de sérum de veau fœtal (SCF) dans un milieu basal de culture de péricytes et conservez-le à 4 °C.

2. Récupération du tissu cérébral et élimination des méninges

1. Pour plus de cohérence, utilisez des souris du même âge et du même sexe dans chaque lot d’extraction. Utilisez un refuge pour animaux exempt d’agents pathogènes et fournissez un accès à l’eau à volonté à volonté. Pour garantir l’efficacité et l’utilisation minimale des animaux, évitez la perte de tissus.
2. Euthanasier C57BL/6J, 4-6 semaines, souris mâles (Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, France).
3. Exciser rapidement le tissu cérébral dans des conditions stériles, éviter tout dommage au tissu. Placez délicatement le mouchoir dans 40 ml de solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS).
4. Transférez le tissu cérébral dans le PBS froid dans une boîte de Pétri (100 mm x 15 mm).
5. Placez le tissu cérébral sur une lingette sèche stérile non pelucheuse et, à l’aide d’une pince à pointe incurvée, retirez le cervelet, le striatum et les nerfs occipitaux.
   1. Retirez toutes les méninges visibles à l’aide d’un coton-tige. Placez le tissu cérébral à l’envers et ouvrez les lobes avec un coton-tige en utilisant de légers mouvements vers l’extérieur. Retirez tous les vaisseaux sanguins visibles.
   2. Placez le tissu cérébral libre des méninges dans une boîte de Pétri (100 mm x 15 mm) avec 15 ml de WBB froid.

3. Homogénéisation

1. Transférez le tissu dans un tube de mortier de broyeur de tissu Dounce et ajoutez 3 à 4 ml de WBB avec une pince.
2. Hachez le mouchoir avec un pilon lâche 55 fois. Rincez le pilon « lâche » avec WBB. Maintenant, hachez la bouillie avec un pilon « serré » 25 fois.
3. Répartissez la suspension en deux tubes de 50 ml et ajoutez 1,5 fois le volume de BSA-dextran froid à 30 %, en secouant vigoureusement les tubes pour mélanger la bouillie.

4. Isolement de la fraction vasculaire

1. Après avoir vigoureusement secoué les tubes, centrifugez-les pendant 25 min à 3 000 x g et 4 °C.
2. Transférez le surnageant (avec la couche supérieure de myéline) dans 2 nouveaux tubes et centrifugez les tubes pendant 25 min à 3 000 x g et 4 °C. Conservez les granulés de la première centrifugation en ajoutant 3 ml de WBB froid (maintenez le granulé à 4 °C).
3. Répétez l’étape 4.2 et conservez soigneusement les granulés de la 2ème centrifugation.
4. Jetez le dextran et la myéline avec les débris tissulaires des tubes à partir de l’étape 4.3. Conservez les granulés dans le WBB froid.
5. Regrouper le contenu des tubes 1 et 2 à partir de l’étape 4.1 et porter le volume final à 10 mL avec du WBB froid.
6. Répétez cette étape pour les tubes des étapes 4.2 et 4.3.
   REMARQUE : Enfin, il y a 3 tubes issus de 3 centrifugations.
7. Dissociez la pastille en 6 mouvements de haut en bas à l’aide d’une pipette de 10 mL jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’amas visibles de granules.
8. Filtrez les suspensions de cellules de chaque tube à l’aide d’un ensemble de filtre à vide et d’un filtre à mailles en nylon.
   note: Cette étape de filtration est importante afin d’éliminer les récipients plus longs/plus grands via le filtre à mailles.
9. Récupérez et remettez en suspension les capillaires en raclant le filtre à l’aide d’une pince à pointe plate ou d’un grattoir en WBB à température ambiante. Filtrez la suspension avec un filtre neuf pour récupérer plus de capillaires
10. Diviser le filtrat en deux tubes à parts égales et centrifuger pendant 7 min à 1 000 x g et RT.
    REMARQUE : Au cours de cette étape de centrifugation, préparez la solution enzymatique. Déterminer le volume de WBB requis en fonction du nombre d’animaux utilisés (voir le tableau des matériaux). Ajouter 1 fois la DNase 1 et 1 fois le chlorhydrate de tosyl-L-lysyl-chlorométhane (TLCK) (voir le tableau des matériaux) dans le WBB et préchauffer à 37 °C.
11. Récupérez les granulés de l’étape 4.10 dans un tube avec du WBB préchauffé avec des enzymes. Ajouter 1x collagénase/dispase préchauffée. Placez le tube dans le bain-marie de la table vibrante à 37 °C pendant 33 minutes précises.
12. Arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant 30 ml de WBB froid. Centrifuger la suspension pendant 7 min à 1 000 x g et RT.
13. Jetez soigneusement le surnageant et dissociez la pastille dans WBB en 6 mouvements de haut en bas à l’aide d’une pipette de 10 ml. Cette étape devrait être moins rigoureuse et comparativement plus rapide.
14. Centrifuger la suspension pendant 7 min à 1 000 x g et RT.
    REMARQUE : Au cours de cette étape, jetez l’enrobage des plats de culture et rincez-les une fois avec du DMEM à température ambiante. Enduire les boîtes de culture cellulaire pendant au moins 1 h à RT.
15. Jeter le surnageant du tube obtenu à l’étape 4.14, et dissocier la pastille dans un nouveau milieu DMEM complet, mettre les cellules en plaques (Jour 0, P0) dans 9 puits de plaques à 6 puits (1 puits de 9,6 cm2 chacun).

5. Prolifération des péricytes cérébraux

1. Maintenez les cultures cellulaires à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un incubateur stérile. Remplacez le milieu de culture après 24 h (jour 1) de placage des cellules en retirant soigneusement les débris. Après le jour 1, changez le milieu de culture toutes les 48 heures.
2. Observez la culture cellulaire pendant au moins 7 à 8 jours. À ce moment-là, les excroissances cellulaires sur le dessus de l’unicouche endothéliale devraient être observables.
3. Passage des cellules du jour 8 au 10 (selon la confluence) dans un milieu de culture de péricytes jusqu’au passage 1 (P1) sur des plaques de culture enrobées de gélatine. Changez le milieu de culture tous les 2 jours. Observez les cellules pendant 6 à 7 jours. Les cellules sont à nouveau divisées consécutivement jusqu’au passage 2 (P2) le jour 17 [et au passage 3 (P3) le jour 24 seulement si nécessaire], cultivées dans un milieu péricytaire dans des plaques enrobées de gélatine.
   note: Les cellules doivent être prêtes pour les expériences/observations à près de 80-90 % de confluence.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acides aminés BME	sigma	Réf. B-6766	Conserver à 4 °C.
Milieux DMEM de base	Invitrogen	316000083	Conserver à 4 °C.
Facteur de croissance des fibroblastes de base	sigma	F-0291	Conserver à -20 °C.
Bsa	sigma	A-8412	Conserver à 4 °C.
Collagénase dispase	sigma	10269638001	Préparez une solution mère 10x dans du PBS-CMF stérile. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm et la conserver à -20 °C. Remarque : Pour l’étape de digestion enzymatique du protocole, pour chaque ensemble de 10 souris à extraire, 300 μL de collagénase dispase 10x sont nécessaires.
dextrane	sigma	Référence 31398
DNase I	sigma	11284932001	Préparez une solution mère 1000X en dissolvant 100 mg dans 10 ml d’eau stérile et conservez-la à -20°C.
gélatine	sigma	G-2500	Préparez l’enrobage de travail en préparant une solution de gélatine à 0,2 % dans du PBS-CMF stérile (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 0,2 g/L de KH2PO4, 2,86 g/L de NaHPO4 (12 H2O), pH de 7,4). Autoclavez la solution pendant au moins 20 minutes à 120 °C et conservez-la à température ambiante. Boîtes de culture à enrober pendant au moins 4 heures à 4 °C.
La gentamycine	Biochrom AG	A-2712	Conserver à 4 °C.
glutamine	Merck	I.00289	Conserver à -20 °C.
HBSS	sigma	N° H-8264	Conserver à 4 °C.
HEPES	sigma	N° H-0887	Conserver à 4 °C.
Matrigel	BD Biocoat	Référence 354230	Préparez une solution d’enrobage fonctionnelle de Matrigel en diluant la matière dans du DMEM froid dans un rapport de 1:48 avec sa concentration finale de 85 μg/cm2. Les boîtes de culture cellulaire doivent être enrobées au moins 1 heure à température ambiante.
Pericyte Medium-souris	Laboratoires de recherche Sciencell	N° 1231	Conserver à 4 °C.
Tosyllysine chlorométhylcétone	sigma	T-7254	Préparez une solution mère 1000X dans du WBA en dissolvant 16 mg dans 10,88 mL de WBA pour obtenir une solution de 4 mM et conservez-la à 4 °C.
vitamine	sigma	Réf. B-6891	Conserver à -20 °C.
Outils de filtration	Sefar, maille de nylon, porosité de 60 microns
équipement de laboratoire	Centrifugeuse à rotor à godets oscillants
Bain-marie avec agitateur
Hotte à flux laminaire : BSL2
Verrerie (tous les composants doivent être stérilisés à la chaleur)	Broyeur de mouchoirs en papier avec pilon en verre
Pilon I : 0,0035 à 0,0065 pouces
Pilon II : 0,0010 à 0,0030 pouces
Ensemble de filtre sous vide avec base de support de filtre en verre fritté à porosité grossière