Obtention d’une suspension unicellulaire à partir de tissu hippocampique de souris

Résumé

Source : Trujillo, M., et al. Dissociation mécanique et enzymatique combinée du tissu hippocampique du cerveau de la souris. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo présente un protocole permettant d’obtenir une suspension unicellulaire hautement viable à partir de l’hippocampe du cerveau de la souris en utilisant une combinaison de dissociation mécanique automatisée et d’un mélange d’enzymes pour faciliter la digestion enzymatique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparez les mélanges d’enzymes 1 et 2 pour chaque échantillon

REMARQUE : Pour les volumes supérieurs à 2 mL, utiliser une pipette sérologique de 10 mL ; pour les volumes, 200 μL-2 mL, utiliser une pipette de 1000 μL ; pour les volumes, 21-199 μL, utiliser une pipette de 200 μL ; pour les volumes, 2-20 μL, utiliser une pipette de 20 μL ; pour les volumes inférieurs à 2 μL, utiliser une pipette de 0-2 μL.

1. Pour chaque échantillon, décongeler une aliquote de l’enzyme P et de l’enzyme A à température ambiante.
2. Pour le mélange d’enzymes 1, combinez 50 μL d’enzyme P et 1900 μL de tampon Z dans un tube C étiqueté (table des matériaux).
3. Pour le mélange d’enzymes 2, ajoutez 20 μL de tampon Y à l’aliquote décongelée de 10 μL d’enzyme A.

2. Protocole de dissociation du cerveau adulte

REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des échantillons, les tubes doivent être placés dans un support de tubes à température ambiante tandis que le BSA et le D-PBS restent sur la glace, sauf indication contraire.

1. Allumez le dissociateur.
2. À l’aide d’une pince, transférez les morceaux de tissu de l’hippocampe dans le tube C.
3. Transférez 30 μL du mélange d’enzymes 2 dans le tube C. Tournez le capuchon jusqu’à ce que la tension se fasse sentir, puis serrez jusqu’à ce qu’il s’enclenche.
4. Placez le tube C à l’envers dans une position du dissociateur ; l’échantillon se verra attribuer l’état Sélectionné (Figure 1). Fixez l’appareil de chauffage sur le tube C.
5. Appuyez sur l’icône du dossier, sélectionnez le dossier Favoris, faites défiler et sélectionnez le programme 37C_ABDK_02. Cliquez sur OK pour appliquer le programme à tous les tubes C sélectionnés, puis appuyez sur Démarrer (Figure 1).
6. Étiqueter un tube conique de 50 mL par échantillon.
7. Placez une crépine à cellules de 70 μm sur chaque tube conique de 50 mL et mouillez avec 2 mL de tampon BSA.
8. Une fois le programme terminé, retirez le radiateur et le tube C du dissociateur.
9. Ajouter 4 mL de tampon BSA à l’échantillon et appliquer le mélange dans la crépine de la cellule sur le tube conique de 50 mL.
10. Ajoutez 10 ml de D-PBS dans le tube C, fermez-le et faites tourner doucement la solution. Appliquez-le sur la crépine de la cellule sur le tube conique de 50 ml.
11. Jetez la crépine de la cellule et le tube C. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 10 min à 4°C. Ensuite, aspirez et jetez le surnageant.

3. Enlèvement des débris

1. Remettez la pastille en suspension avec 1550 μL de D-PBS froid et transférez la suspension dans un tube conique étiqueté de 15 mL.
2. Ajouter 450 μL de solution d’élimination des débris froids et pipeter de haut en bas (ne pas vortex).
   note: La solution d’élimination des débris est un réactif dans le kit commercial de dissociation de Brian pour adultes.
3. Superposez doucement 1 mL de D-PBS froid sur la suspension cellulaire, en maintenant l’extrémité contre la paroi du tube conique. Répétez l’opération jusqu’à ce que la surface totale soit de 2 mL
   note: Cette étape est cruciale ; faire preuve de compétence et de dextérité.
4. Centrifugeuse à 3000 x g pendant 10 min à 4°C avec accélération maximale et freinage à fond.
   note: Si les phases ne sont pas clairement séparées, répétez les étapes 7.2 et 7.3. Centrifuger une dernière fois à 1000 x g pendant 10 min à 4°C.
5. La suspension doit maintenant être composée de trois couches distinctes (Figure 2). Aspirez la couche supérieure. Balayez l’extrémité de la pipette d’avant en arrière pour aspirer la couche intermédiaire blanche. Retirez autant que possible la couche intermédiaire sans déranger la couche inférieure.
   note: Cette étape est cruciale ; faire preuve de compétence et de dextérité.
6. Ajouter 2 ml de D-PBS froid et pipeter de haut en bas pour mélanger.
7. Centrifugeuse à 1000 x g pendant 10 min à 4°C avec accélération maximale et freinage complet. Aspirez et jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon BSA.
   REMARQUE : Les cellules peuvent être remises en suspension dans le tampon approprié, puis marquées magnétiquement et isolées en préparation du séquençage d’une seule cellule à ce stade.

Résultats

Figure 1 : état sélectionné à l’étape 2.4

Figure 2 : Suspension tricouche à l’étape 3.5 : Tampon (couche supérieure), débris cellulaires, solution d’élimination des débris et cellules (couche inférieure).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	Fisher Scientific	Tél. : 02-682-003	Basix, couleurs assorties
Tubes Falcon de 15 ml	Becton Dickinson Labware Europe	352009	polystyrène
25 mL de pipettes sérologiques	Fisher Scientific	Tél. : 14-955-235
Crépine à cellules de 70 μm	Fisher Scientific	Référence 08-771-2
Kit de dissociation cérébrale adulte	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-107-677	Contient l’enzyme P, le tampon Z, le tampon Y, l’enzyme A, le tampon A, la solution d’élimination des débris
Bsa	Sigma-Aldrich	A7906-50G
Falcon 50 mL Tubes de centrifugation coniques	Fisher Scientific	Tél. : 14-432-22
Tubes McS C	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator avec radiateurs	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Bécher en verre	Fisher Scientific	Référence 02-555-25A
Pointes de pipette GP LTS 20 μL 960A/10	Rainin	30389270
Pointes de pipette GP LTS 250 μL 960A/10	Rainin	30389277
Pointes de pipette RT LTS 1000 μL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
Seau à glace rond avec couvercle	Fisher Scientific	Tél. : 07-210-129
Tubes à fond rond avec capuchon de crépine de cellule	Faucon	Référence 100-0087