Préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir de tissu cérébral murin

Résumé

Source : DiSano, K. D., et al. Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires. J. Vis. Exp. (2020).

La vidéo montre la préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir d’un tissu cérébral murin. Il implique une digestion enzymatique pour libérer les cellules du tissu cérébral, suivie d’une centrifugation à gradient de densité pour isoler les cellules immunitaires en fonction de leur densité afin d’obtenir la suspension unicellulaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation de suspensions unicellulaires de tissu cérébral et de moelle épinière

1. Transférez le tissu du cerveau ou de la moelle épinière avec le milieu vers le haut de la boîte de Pétri de 100 mm en versant le tissu et le milieu du tube. À l’aide d’une pince, déplacez le tissu au fond de la boîte de Pétri. Hachez finement le cerveau ou la moelle épinière avec une lame de rasoir stérile. À l’aide de la lame de rasoir, déplacez le tissu haché vers le bas de la plaque en gratta....

Résultats

Graphique 1 : Identification des cellules immunitaires infiltrant CD45hi dans les tissus du SNC. (A) Stratégie de contrôle pour l’identification des cellules immunitaires infiltrantes CD45hi (P1), de la microglie CD45lo (P2) et des oligodendrocytes, astrocytes et neurones CD45- parmi les cellules vivantes totales de la moelle épinière de souris traitées par placebo (rouge) ou TMEV-IDD (bleu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine	ThermoFisher Scientific	Référence 37002D
centrifugeuse	Beckman Coulter	Centrifugeuse Allegra X-12R
Collagénase I	Worthington	LS004196
Tube conique, 15 mL	VWR	Référence 525-1069
Tube conique, 50 mL	VWR	Référence 89039-658
Verre de protection	Hauser Scientific	5000
Pince incurvée	Outils scientifiques fins	Référence 11003-14
Tube jetable en polystyrène, 14 mL	Fisher Scientific	Référence : 14-959-1B
DNase I	Worthington	LS002139
neige carbonique	Gaz à air	n/a
Durmont #7Forceps	Outils scientifiques fins	Référence 11271-30
EDTA sel disodique dihydraté	Amresco	0105-500g
Éthanol, 100 %	quelconque	n/a
Tube supérieur du filtre, 5 mL	VWR	352235
Teinture de viabilité fixable 780	Becton Dickinson	565388
glucose	Fisher Chemical	D16-500
Solution saline de Hank (HBSS)	Corning	Référence 21-020-CV
Hémacytomètre	Andwin Scientific	Tél. : 02-671-51B
Hémostat	Outils scientifiques fins	Référence 13004-14
HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique)	ThermoFisher Scientific	15630080
Kcl	Fisher chimique	BP366-500
KH2PO4 (anhydre)	Sigma Aldrich	P5655-100G
azote liquide	Gaz à air	n/a
Bloc FC souris (CD16/32)	Becton Dickinson	553141
Na2HPO4 (anhydre)	Fisher Chemical	S374-500
NaCl	Fisher chimique	S671-500
Aiguille, calibre 25	Becton Dickinson	305122
Sérum de souris normal	ThermoFisher Scientific	Référence 31881
Passoire en maille de nylon	VWR	Référence 352350
opo	Sakura	Réf. 4583
Paraformaldéhyde, 20 %	Sciences de la microscopie électronique	15713-S	Dilué à 4 % avec 1 x PBS
Pipette Pasteur, 9 pouces, débranchée	Fisher Scientific	13-678-20C
PBS (1x)	Corning	Référence 21-040-CV
PE Rat Anti-Souris CD4	Becton Dickinson	Référence 553730
PE-CF594 Anti-souris pour rat CD19	Becton Dickinson	562329
Média à gradient de densité Percoll	GE Soins de santé	Référence 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Anti-souris pour rats CD45	Becton Dickinson	550994
Boîte de Pétri, 100 mm	VWR	353003
Ph-mètre	Fisher Scientific	13-636-AB150
Pipet-Aid	Corporation Drummond Scientific	Réf. 4-000-101
Pipette 200 μl	Gilson	FA10005M
Pointes de pipette, 1 mL	Scientifique américain	Référence 1111-2831
Pointes de pipette, 200 μl	Scientifique américain	1111 à 1816
Pipette, 1 mL	Gilson	FA10006M
Prolonge de l’enrobage diamant avec DAPI	ThermoFisher Scientific	Réf. P36962
Anti-souris Rat Purifié CD16/CD32	Becton Dickinson	553141
Lapin anti-souris CD3 (clone SP7)	Abcam	AB16669
Lammine anti-souris lapin	Abcam	AB11575
Anti-souris rat ERT-R7	Abcam	AB51824
RPMI 1640	Corning	10-040-CV
Pipette sérologique, 1 mL	VWR	357521
Pipette sérologique, 10 mL	VWR	357551
Pipette sérologique, 5 mL	VWR	357543
hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S318-100
saccharose	Fisher chimique	S5-500
Ciseaux chirurgicaux	Outils scientifiques fins	Référence 14001-16
Ciseaux chirurgicaux, extra fins	Roboz	RS-5882
Seringue, 10 mL	Becton Dickinson	302995
Seringue, 5 mL	Becton Dickinson	309646
Trypan bleu	Gibco	Référence 15250-061