Préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir de tissu cérébral murin

Résumé

Source : DiSano, K. D., et al. Isolement des tissus du système nerveux central et des méninges associées pour l’analyse en aval des cellules immunitaires. J. Vis. Exp. (2020).

La vidéo montre la préparation d’une suspension unicellulaire de cellules immunitaires à partir d’un tissu cérébral murin. Il implique une digestion enzymatique pour libérer les cellules du tissu cérébral, suivie d’une centrifugation à gradient de densité pour isoler les cellules immunitaires en fonction de leur densité afin d’obtenir la suspension unicellulaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation de suspensions unicellulaires de tissu cérébral et de moelle épinière

1. Transférez le tissu du cerveau ou de la moelle épinière avec le milieu vers le haut de la boîte de Pétri de 100 mm en versant le tissu et le milieu du tube. À l’aide d’une pince, déplacez le tissu au fond de la boîte de Pétri. Hachez finement le cerveau ou la moelle épinière avec une lame de rasoir stérile. À l’aide de la lame de rasoir, déplacez le tissu haché vers le bas de la plaque en grattant pour rassembler le tissu.
   note: Pour le protocole de digestion enzymatique ci-dessous, jusqu’à deux moelles épinières peuvent être regroupées pour le traitement. Les cerveaux doivent être traités individuellement.
2. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml, ajouter 3 mL de milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) (complété par 10 % de sérum de veau fœtal (SCF) dans la boîte de Pétri. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, pipeter de haut en bas pour remettre le tissu en suspension dans le milieu et transférer dans un tube conique de 15 mL.
   note: Si l’application en aval est l’analyse ou la culture cellulaire de séquençage d’ARN unicellulaire ou en vrac, les lots de FCS doivent être testés pour s’assurer que les cellules ne sont pas activées avant l’analyse. Alternativement, les cellules peuvent être traitées à l’aide de 1x PBS avec 0,04 % de BSA au lieu de RPMI avec 10 % de FCS.
3. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, laver la boîte de Pétri avec 2 ml de milieu supplémentaire pour recueillir tout tissu résiduel et transférer dans un tube conique pour un volume total de 5 ml. Gardez les tubes sur de la glace entre les étapes de traitement.
4. À l'aide d'une pipette, remettre en suspension la poudre de collagénase I dans le milieu de la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour obtenir la concentration souhaitée (c.-à-d. 100 mg/mL). Ajouter la collagénase de type I dans le tube conique contenant l’échantillon de tissu haché pour obtenir la concentration finale souhaitée (c.-à-d. 50 μL pour 1 mg/mL).
   note: Des concentrations plus élevées de collagénase augmenteront les rendements cellulaires, mais peuvent cliver les marqueurs de surface cellulaire. Par conséquent, les lots de collagénase I doivent être titrés pour déterminer la concentration optimale nécessaire pour obtenir le plus grand nombre de cellules viables avec tous les marqueurs de surface cellulaire requis intacts. Par exemple, la collagénase I a été testée à des concentrations finales de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL et 2 mg/mL sur des échantillons uniques de cerveau ou de moelle épinière. La viabilité cellulaire a été déterminée à l’aide de la méthode d’exclusion au bleu trypan et les marqueurs de surface cellulaire CD45, CD19 et CD4 ont été évalués par cytométrie en flux. Une concentration de 1 mg/mL de collagénase I a donné le nombre de cellules vivantes le plus élevé tout en conservant tous les marqueurs de surface cellulaire d’intérêt. Ainsi, cette concentration a été utilisée pour d’autres expériences examinant ces types de cellules.
5. Remettre doucement en suspension la poudre de DNase I à l’aide de chlorure de sodium 0,15 M jusqu’à la concentration de base souhaitée. Ajouter la DNase I remise en suspension dans le tube conique contenant l’échantillon de tissu haché pour obtenir une concentration finale de 20 U/mL.
   note: Les lots de DNase I varient selon les unités d’activité par ml. La concentration à ajouter à l'échantillon de tissu changera en fonction des unités d'activité par millilitre du flacon de stock. La concentration finale souhaitée par échantillon est de 20 U/mL.
6. Placez les tubes dans un support à tubes dans un bain-marie à 37 °C et incubez pendant 40 min. Retournez les tubes toutes les 15 minutes pour bien mélanger le tissu avec les enzymes. Après l’incubation, ajouter 500 μL d’EDTA 0,1 M (pH = 7,2) dans chaque tube pour une concentration finale de 0,01 M EDTA et incuber pendant 5 minutes supplémentaires pour inactiver la collagénase.
7. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, ajouter 9 ml de RPMI complété par 10 % de FCS dans chaque tube pour porter le volume de chaque tube à ~14,5 mL. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette Pasteur sous vide, aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas toucher la pastille cellulaire.
8. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml, ajouter 3 ml de solution mère à gradient de densité isotonique à 100 % dans le tube contenant la pastille de cellule. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, ajoutez un milieu RPMI 10 % FCS supplémentaire pour porter le volume final à 10 ml et remettez en suspension la pastille cellulaire pour créer une couche de solution à gradient de densité isotonique de 30 %.
   note: Préparez à l’avance le milieu à gradient de densité isotonique à 100 %, aliquotez-le et conservez-le à 4 °C jusqu’à 3 mois. Pour préparer la solution mère à gradient de densité isotonique à 100 %, diluez le milieu à gradient de densité (tableau des matériaux) avec un tampon de dilution de milieu à gradient de densité. Préparez le tampon de dilution du milieu à gradient de densité (80,0 g/L de NaCl, 3,0 g/L de KCl ; 0,73 g/L de Na₂HPO₄, 0,20 g/L de KH₂PO₄ ; 20,0 g/L de glucose) et filtrez la stérilisation à l’aide d’un système de filtration sous vide. Préparez la solution mère à gradient de densité isotonique à 100 % en mélangeant 1 partie du tampon de dilution du gradient de densité et 9 parties de milieu à gradient de densité. Bien mélanger.
9. Retournez et mélangez bien chaque tube avant d’ajouter la sous-couche de solution de gradient de densité isotonique à 70 %. Insérer une pipette sérologique de 1 mL contenant 1 mL de solution mère à gradient de densité isotonique à 70 % dans le fond du tube. Sous-couche lentement 1 mL de la solution, en prenant soin de ne pas faire de bulles. Retirez lentement la pipette sérologique du tube en faisant attention de ne pas perturber le gradient.
   note: Pour la sous-couche à 70 %, la solution mère à gradient de densité isotonique à 100 % doit être diluée à 70 % à l’aide d’un milieu RPMI (c.-à-d. 7 mL de solution mère à gradient de densité isotonique à 100 % et 3 mL de milieu RPMI bien mélangés). De plus, la création d’une sous-couche propre et non perturbée à 70 % est essentielle pour l’élimination des débris de myéline et pour l’obtention de suspensions unicellulaires pures à l’interface du gradient après la centrifugation.
10. Centrifugeuse à 800 x g pendant 30 min à 4 °C sans frein. Aspirez le surnageant, y compris la couche de débris de myéline, jusqu’à ce qu’il reste 2 à 3 ml dans le tube, en prenant soin de ne pas perturber la couche cellulaire. Récoltez la couche cellulaire entre le gradient de densité de 30/70 % à l’aide d’une pipette de 1 mL et transférez-la dans un nouveau tube conique de 15 mL.
11. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, ajouter un milieu RPMI 10 % FCS pour porter le volume final à 15 ml. Centrifugeuse 450 x g pendant 5 min à 4 °C.
    note: Au cours de cette étape, les couches cellulaires de deux tubes peuvent être regroupées si nécessaire. Ne mettez pas en commun plus de deux tubes, sinon les cellules ne s’aggloméreront pas en raison d’une concentration de média à gradient de haute densité.
12. Aspirez le surnageant avec précaution pour ne pas déranger la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans un volume/tampon approprié pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre (p. ex., remettre en suspension une seule moelle épinière dans 250 μL de tampon FACS pour la coloration de surface en aval) (figure 1).
13. À l’aide d’une pipette de 1 ml, transférez les suspensions de cellules dans le haut d’un tube supérieur de filtre (tableau des matériaux) et laissez les cellules filtrer vers le bas du tube pour éliminer les débris de myéline restants.
14. À l’aide d’un colorant d’exclusion au bleu de trypan, diluez-le et comptez les cellules sur un hémocytomètre en faisant la moyenne d’au moins deux grilles de 16 carrés pour plus de précision40,41.
15. Procéder à la technique d’analyse de cellule unique.
    note: À l’aide de diverses formes de collagénase (c’est-à-dire D, type I, type II, type IV), les cellules immunitaires, la microglie (Figure 1), les astrocytes, les péricytes, les cellules endothéliales49 et les neurones50 peuvent tous être isolés efficacement. Le nombre de cellules nucléées obtenues pour les résultats était le suivant à l’aide de l’enzyme collagénase I titrée : Cerveau entier traité par placebo = 500 000 à 600 000 cellules ; Cerveau entier TMEV-IDD = 800 000 à 1 000 000 cellules ; Moelle épinière entière traitée placebo = 150 000 à 200 000 cellules ; Moelle épinière TMEV-DID entière = 300 000 à 400 000. Le nombre de cellules variera en fonction de la précision de la collecte, du traitement et de la présence ou non d’une inflammation du SNC.

Résultats

Graphique 1 : Identification des cellules immunitaires infiltrant CD45hi dans les tissus du SNC. (A) Stratégie de contrôle pour l’identification des cellules immunitaires infiltrantes CD45hi (P1), de la microglie CD45lo (P2) et des oligodendrocytes, astrocytes et neurones CD45- parmi les cellules vivantes totales de la moelle épinière de souris traitées par placebo (rouge) ou TMEV-IDD (bleu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine	ThermoFisher Scientific	Référence 37002D
centrifugeuse	Beckman Coulter	Centrifugeuse Allegra X-12R
Collagénase I	Worthington	LS004196
Tube conique, 15 mL	VWR	Référence 525-1069
Tube conique, 50 mL	VWR	Référence 89039-658
Verre de protection	Hauser Scientific	5000
Pince incurvée	Outils scientifiques fins	Référence 11003-14
Tube jetable en polystyrène, 14 mL	Fisher Scientific	Référence : 14-959-1B
DNase I	Worthington	LS002139
neige carbonique	Gaz à air	n/a
Durmont #7Forceps	Outils scientifiques fins	Référence 11271-30
EDTA sel disodique dihydraté	Amresco	0105-500g
Éthanol, 100 %	quelconque	n/a
Tube supérieur du filtre, 5 mL	VWR	352235
Teinture de viabilité fixable 780	Becton Dickinson	565388
glucose	Fisher Chemical	D16-500
Solution saline de Hank (HBSS)	Corning	Référence 21-020-CV
Hémacytomètre	Andwin Scientific	Tél. : 02-671-51B
Hémostat	Outils scientifiques fins	Référence 13004-14
HEPES (acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique)	ThermoFisher Scientific	15630080
Kcl	Fisher chimique	BP366-500
KH2PO4 (anhydre)	Sigma Aldrich	P5655-100G
azote liquide	Gaz à air	n/a
Bloc FC souris (CD16/32)	Becton Dickinson	553141
Na2HPO4 (anhydre)	Fisher Chemical	S374-500
NaCl	Fisher chimique	S671-500
Aiguille, calibre 25	Becton Dickinson	305122
Sérum de souris normal	ThermoFisher Scientific	Référence 31881
Passoire en maille de nylon	VWR	Référence 352350
opo	Sakura	Réf. 4583
Paraformaldéhyde, 20 %	Sciences de la microscopie électronique	15713-S	Dilué à 4 % avec 1 x PBS
Pipette Pasteur, 9 pouces, débranchée	Fisher Scientific	13-678-20C
PBS (1x)	Corning	Référence 21-040-CV
PE Rat Anti-Souris CD4	Becton Dickinson	Référence 553730
PE-CF594 Anti-souris pour rat CD19	Becton Dickinson	562329
Média à gradient de densité Percoll	GE Soins de santé	Référence 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Anti-souris pour rats CD45	Becton Dickinson	550994
Boîte de Pétri, 100 mm	VWR	353003
Ph-mètre	Fisher Scientific	13-636-AB150
Pipet-Aid	Corporation Drummond Scientific	Réf. 4-000-101
Pipette 200 μl	Gilson	FA10005M
Pointes de pipette, 1 mL	Scientifique américain	Référence 1111-2831
Pointes de pipette, 200 μl	Scientifique américain	1111 à 1816
Pipette, 1 mL	Gilson	FA10006M
Prolonge de l’enrobage diamant avec DAPI	ThermoFisher Scientific	Réf. P36962
Anti-souris Rat Purifié CD16/CD32	Becton Dickinson	553141
Lapin anti-souris CD3 (clone SP7)	Abcam	AB16669
Lammine anti-souris lapin	Abcam	AB11575
Anti-souris rat ERT-R7	Abcam	AB51824
RPMI 1640	Corning	10-040-CV
Pipette sérologique, 1 mL	VWR	357521
Pipette sérologique, 10 mL	VWR	357551
Pipette sérologique, 5 mL	VWR	357543
hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S318-100
saccharose	Fisher chimique	S5-500
Ciseaux chirurgicaux	Outils scientifiques fins	Référence 14001-16
Ciseaux chirurgicaux, extra fins	Roboz	RS-5882
Seringue, 10 mL	Becton Dickinson	302995
Seringue, 5 mL	Becton Dickinson	309646
Trypan bleu	Gibco	Référence 15250-061