Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation de la lampe à lumière douce (jour 1)
- Utilisez un panneau acrylique transparent d’une épaisseur de 0,3 à 0,5 cm de la taille d’un papier A5. Collez des tampons blancs à l’avant et à l’arrière de la plaque acrylique.
- Installez une rangée de lumières blanches à DEL sur le bord de la plaque afin que les lumières puissent entrer par le côté de la plaque acrylique, puis sortir en parallèle (Figure 1A-F, Figure 2B).
note: Comme les diamètres des EB au stade précoce sont d’environ 200 μm à 300 μm, il est difficile de les observer clairement à l’œil nu sous la lampe fluorescente des bancs propres. En revanche, en raison de l’amélioration de la réflexion diffuse, nous pouvons détecter clairement les EB en utilisant une lumière douce éclairée latéralement (Figure 2B, C). Une plaque à 6 puits est recommandée pour les cultures d’EB dans les expériences ultérieures. Cependant, pour mieux montrer l’effet visuel de la lumière douce, les plats sont parfois utilisés pour prendre des photos et des vidéos dans cette étude au lieu de plaques, alors s’il vous plaît ne vous méprenez pas. La lampe à lumière douce éclairée latéralement peut également être utilisée pour la plaque à 6 puits.
2. Transfert EB et remplacement du support (jours 2-5)
- Préparez une nouvelle plaque à 6 puits à faible adhérence et ajoutez 2 ml de milieu de formation de corps embryoïde (EB) dans chaque puits.
- Retirez les EB avec le milieu à l’aide d’une pointe de pipette à large calibre de 1000 μL (voir le tableau des matériaux) et transférez-les sur la plaque à faible adhérence à 6 puits (~100 EBs/puits).
note: Le processus de fonctionnement adopte une lampe à lumière douce (mentionnée à l’étape 1) pour faciliter l’observation des EB. Éteignez les autres sources de lumière intérieure pour améliorer l’effet visuel de la lumière douce.
- Remplacez par le même volume de milieu de formation d’EB frais tous les jours. Utilisez le flux secondaire pour rassembler les EB vers le centre et changer de support.
- Aspirez lentement l’ancien milieu en le pipetant lentement jusqu’au bord du puits. Ne sucez pas trop fort ; sinon, les EB seront supprimés ensemble. Ensuite, ajoutez du milieu frais pour remettre en suspension les EBs.
note: Le principal écoulement secondaire (Figure 2D). Induisez un flux tourbillonnant en faisant pivoter la parabole le long d’une orbite circulaire. En raison de l’écoulement tourbillonnant, un écoulement secondaire est induit et dirigé vers le centre. Les EB ou organoïdes convergent vers le centre du puits en raison de l’écoulement secondaire généré par la rotation, après quoi le changement de milieu ou le transfert d’embryoïdes peut être exécuté facilement.
3. Induction neuronale (jours 5-7)
- Préparez une nouvelle plaque à 6 puits à faible adhérence et ajoutez 3 ml de milieu d’induction neurale (tableau 1) dans chaque puits.
- Allumez la lumière douce latérale (mentionnée à l’étape 1) et éteignez les autres sources de lumière intérieures.
- Transférez les EB dans la plaque à 6 puits avec un milieu d’induction neurale ajouté (~100 EBs/puits). Ajoutez le moins possible du milieu d’origine au nouveau puits.
note: Introduire des compétences simples de transfert d’organoïdes. Naturellement, sous l’effet de la gravité et avec une densité relativement supérieure à celle du milieu, les EB remis en suspension vont progressivement s’enfoncer en appliquant l’opération illustrée à la Figure 2E. Par conséquent, les EB peuvent être transférés facilement. Étant donné que, par rapport aux EB, les cellules libres et les fragments de cellules mortes s’enfoncent plus lentement, la plupart des cellules libres et des fragments de cellules mortes peuvent ainsi être éliminés par cette méthode de sédimentation (Figure 2F).
- Incuber les échantillons à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h
note: Au microscope, le diamètre des EB était d’environ 500 μm et le bord était translucide, indiquant qu’une couche neuroépithéliale s’était formée.
Table 1. Composition du milieu d’induction neurale
| Composants | volume |
| DMEM-F12 | 97 ml |
| Supplément N2 | 1 mL |
| Supplément de glutamax | 1 mL |
| MEM-NEAA | 1 mL |
| héparine | Concentration finale 1 μg/mL |
