1. Préparation des milieux de culture et des outils
- Vaporisez le banc et la zone de travail avec de l’éthanol à 70 % et laissez sécher.
- Vaporisez les outils de dissection, les pinces et les deux boîtes de montre en verre avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher sur le banc.
- Préparez le milieu de Schneider complété (MSS, tableau 1) et placez-le sur de la glace.
- Pipeter 1 mL de SSM dans chacune des boîtes en verre de la montre.
- À l’aide d’une micropipette avec une pointe stérile, transférez les larves fraîchement écloses de la plaque de PBS vers le SSM dans la première boîte de montre en verre. À l’aide d’une micropipette munie d’un embout stérile, transférez les larves fraîchement écloses dans le MSS dans la deuxième boîte de montre en verre.
2. Dissections et cultures cérébrales
- Une fois que les larves sont dans la deuxième boîte de montre en verre avec SSM, disséquez le cerveau des larves à l’aide d’une pince et d’un microscope de dissection. Ajustez le grossissement si nécessaire.
- À l’aide d’une pince, saisissez les crochets buccaux et de l’autre, saisissez doucement le corps à mi-chemin et tirez dans la direction opposée (Figure 1) pour diviser la larve en deux morceaux.
note: Le cerveau sera situé juste derrière les crochets buccaux. Notez qu’il peut y avoir d’autres tissus entourant le cerveau. Soyez très prudent lorsque vous enlevez ces tissus car cela peut endommager le cerveau.
- Une fois que 15 à 20 cerveaux ont été disséqués, ajoutez 1 ml de SSM dans un puits d’un plateau de culture stérile à 12 puits. Transférez les cerveaux fraîchement disséqués dans le SSM à l’aide d’une micropipette et d’une pointe stérile (Figure 2A).
- Placer les cerveaux dans le milieu SSM dans le plateau de culture à 12 puits dans un incubateur à 25 °C pendant 24 h (figure 2A).
Tableau 1 : Recette pour la fabrication de milieux de Schneider supplémentés (SSM). Le tableau indique le volume de tous les ingrédients nécessaires à la préparation de 5 mL de MSS.
| Ingrédient (concentration de départ) | Pour faire 5 ml | Concentration finale |
| Média de la drosophile de Schneider | 3,89 ml | |
| Sérum fœtal bovin (100 %) | 500 μL< | 10 % |
| Glutamine (200 mM) | 500 μL | 20 millions d’euros |
| Pénicilline (5000 unités/mL), Streptomycine (50 000 μg/mL) | 100 μL | Stylo 1000 U/mL, 1 mg/mL Strep |
| Insuline (10 mg/mL) | 10 μL | 0,02 mg/mL |
| glutathion (50 mg/mL) | 5 μL | 0,05 mg/mL |
| Dans une hotte stérile, en utilisant la technique stérile, ajouter tous les ingrédients ensemble dans un tube conique de 14 ml. Placez-le sur de la glace jusqu’à utilisation. |
