Isolement d’oligodendrocytes primaires murins à l’aide de billes immunomagnétiques

Résumé

Source : Flores-Obando, R. E. et al., Isolement immunomagnétique rapide et spécifique des oligodendrocytes primaires de souris. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente une méthode permettant d’isoler des cellules oligodendrocytaires primaires à partir d’une suspension de cellules neurales obtenue à partir d’un bébé souris en utilisant la séparation magnétique. La technique utilise des billes magnétiques recouvertes d’anticorps spécifiques aux antigènes des oligodendrocytes, permettant l’isolement sélectif de ces cellules.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Dissociation du cortex cérébral de la souris

1. Sacrifiez des bébés souris C57Bl/6N âgés de 5 à 7 jours par décapitation rapide avec des ciseaux préalablement nettoyés à 70 % d’éthanol.
   note: Les cortex cérébraux de 5 à 6 bébés souris nouveau-nés ont été utilisés pour chaque préparation. En moyenne, le cerveau d’une souris produit 1-1,5 x 10⁶ oligodendrocytes primaires (Ols).
2. Coupez la peau du cuir chevelu le long de la ligne médiane avec de petits ciseaux de dissection et rétractez-la pour exposer le crâne.
3. Coupez soigneusement le crâne le long de la ligne médiane en partant de l’ouverture à l’arrière du crâne vers la zone frontale, en soulevant avec les ciseaux pour éviter d’endommager le cerveau. Ensuite, à l’aide de l’ouverture à l’arrière du crâne, coupez vers chaque orbite le long de la base du crâne.
4. À l’aide d’une pince fine, on sépare doucement les cortex du mésencéphale et transfère-les dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm contenant 7 ml de B27NBMA. Répétez les étapes 2.2 à 2.4 pour chaque cerveau, en regroupant les cortex disséqués.
5. Transférez les cortex dans une nouvelle boîte de culture tissulaire de 60 mm contenant 5 ml de tampon de dissociation (B27NBMA, 20-30 U/mL de papaïne et 2 500 U de DNase I).
6. Coupez les cortex en petits morceaux d’environ 1^mm3 à l’aide d’une lame de scalpel #15 et incubez pendant 20 min dans un incubateur à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO₂).
7. Ajouter 1 mL de sérum de croissance bovine (SGB) pour arrêter la réaction enzymatique.
8. Transférez les cortex avec le milieu de dissociation dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
9. Commencez doucement à dissocier le tissu cérébral en pipetant lentement de haut en bas 6 à 8 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, en prenant soin de minimiser les bulles.
10. Laissez les morceaux de tissu se déposer pendant 2-3 minutes et transférez le surnageant dans un tube frais.
11. Ajouter 3 ml de B27NBMA contenant 10 % de BGS/2500 U DNase I dans la pastille de tissu.
12. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml, dissociez doucement le tissu cérébral tout en pipetant de haut en bas de 6 à 8 fois. Attention à minimiser les bulles.
13. Laissez les morceaux de tissu reposer pendant 2-3 min.
14. Transférez le surnageant dans un tube frais. Ajouter 3 ml de B27NBMA contenant 10 % de BGS/DNase I à la pastille de tissu.
15. Dissociez doucement le tissu cérébral à l’aide d’une pointe de pipette P1000, tout en pipetant le mélange de milieux et de tissu cérébral de haut en bas. Répétez les étapes 2.13 et 2.14 jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros morceaux de tissu ou jusqu’à ce que B27NBMA contenant 10 % de BGS/DNase I soit épuisée, selon la première éventualité. Attention à minimiser les bulles.
16. Suspension à cellules de piscine avec surnageants précédents.
17. Placez la passoire à cellules de 70 μm dans un tube de 50 mL. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, passer doucement la suspension cellulaire mélangée sur la crépine de 70 μm.
18. Lavez la crépine cellulaire en ajoutant 1 mL de B27NBMA contenant 10 % de BGS/DNase I.
19. Jetez la crépine de cellule. Porter le volume à 30 mL avec un B27NBMA contenant 10 % de BGS/DNase I.
20. Transférez la suspension cellulaire dans deux tubes coniques de 15 ml. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 200 x g.
21. Retirez le surnageant sans laisser les cellules exposées à l’air. Le surnageant sera trouble en raison des débris cellulaires. Ajouter 3 ml de B27NBMA contenant 10 % de BGS à la pastille.
22. Dissociez soigneusement la pastille cellulaire à l’aide d’une pipette P1000. Porter le volume à 15 mL avec des B27NBMA contenant 10 % de BGS.
23. Passez la suspension cellulaire sur une crépine de cellule fraîche de 40 μm.
24. Lavez la passoire cellulaire en ajoutant 1 ml de B27NBMA contenant 10 % de BGS. Jetez la crépine de cellule.
25. Porter le volume à 30 mL avec un B27NBMA contenant 10 % de BGS.
26. Transférez la suspension cellulaire dans 2 tubes coniques de 15 ml. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 200 x g.
27. Retirez la majeure partie du surnageant sans laisser les cellules exposées à l’air. Remettez les pastilles de cellules en suspension dans 5 mL de tampon de tri magnétique de cellules (MCS) glacé.

2. Détermination du nombre de cellules et de la viabilité

1. Diluer 100 μL de la suspension cellulaire avec 400 μL de solution de bleu de trypan dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL pour obtenir une dilution de 1:5 à 0,4 % (p/v).
2. Centrez un verre de couverture sur une chambre d’hémocytomètre et remplissez les deux chambres avec 10 μL de dilution cellulaire à l’aide d’une pipette P10 et en évitant le débordement. La solution passera sous le verre de couverture par capillarité.
3. Placez l’hémocytomètre sur la platine du microscope et ajustez la mise au point à l’aide d’un grossissement de 40X.
   REMARQUE : Le dénombrement des cellules est enregistré à l’aide d’un compteur manuel situé dans chacun des cinq carrés (quatre coins et un au centre). Seules les cellules non viables absorbent le colorant et apparaissent bleues, tandis que les cellules vivantes et saines apparaissent rondes et réfractives et n’absorbent pas le colorant de couleur bleue, ce qui permet de déterminer le nombre de cellules viables et totales par millilitre.

3. Isolement des oligodendrocytes O4⁺

1. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 10 min.
2. Jetez soigneusement le surnageant en utilisant l’aspiration intra-utérine, en évitant d’exposer les cellules à l’air.
3. Remettre la pastille en suspension dans 90 μL de tampon MCS par 1 x 10⁷ cellules totales, suivie de l’ajout de 10 μL de billes anti-O4 par 1 x 10⁷ cellules.
4. Mélangez la suspension cellulaire et les billes en tapotant doucement le tube conique de 15 ml avec le doigt 4 à 5 fois.
5. Incuber le mélange pendant 15 minutes à 4 °C, en agitant le tube conique de 15 ml avec le doigt 4 à 5 fois toutes les 5 minutes.
6. Lavez le mélange en ajoutant délicatement 2 ml de tampon MCS par 1 x 10⁷ cellules dans le tube. Centrifuger le mélange à 200 x g pendant 10 min.
7. Jetez le surnageant en utilisant soigneusement l’aspiration intra-utérine, en évitant l’exposition des cellules à l’air. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 500 μL de tampon MCS pour 1 x 10⁷ cellules.
8. Fixez un séparateur magnétique à un support de séparateur magnétique. Fixez une colonne de sélection au séparateur magnétique et placez une crépine de cellule de 40 μm sur le dessus de la colonne. Placez deux tubes coniques de 15 ml ou un tube conique de 50 ml sous la colonne de séparation pour recueillir le débit.
9. Pré-rincez la crépine de cellules de 40 μm et la colonne de séparation avec 3 ml de tampon MCS et laissez le tampon traverser la colonne sans la laisser sécher.
10. Ajoutez le mélange de suspension cellulaire et de billes dans la crépine de cellule et dans la colonne de sélection.
11. Lavez la crépine de 40 μm avec 1 mL de tampon MCS.
12. Jetez la crépine cellulaire et laissez le mélange de cellules, de billes et de tampon s’écouler dans la colonne sans la laisser sécher.
13. Laver la colonne de séparation 3 fois avec 3 mL de tampon MCS et 1 fois avec un milieu de prolifération OL.
14. Retirez la colonne de séparation du séparateur magnétique, placez-la rapidement dans un tube conique de 15 ml et ajoutez immédiatement 5 ml de milieu de prolifération OL.
15. Placez un piston sur le dessus de la colonne et poussez fermement pour rincer les cellules marquées dans le tube conique de 15 ml.
16. Prélever 100 μL de suspension cellulaire pour déterminer la numération et la viabilité des cellules à l’aide du Trypan Blue et de l’hémocytomètre, comme indiqué à la rubrique 3.
    REMARQUE : Une viabilité cellulaire supérieure à 80 % est considérée comme acceptable pour procéder à la culture des LO, mais une viabilité supérieure à 90 % est optimale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10ml de pipettes sérologiques	Fisher Scientific	Référence 13-676-10J
Seringue Luer-Loc de 10 ml	BD, Becton Dickinson	309604
Tubes coniques de 15 ml	Faucon	352097
Plaques de culture tissulaire à 24 puits	Faucon	353935
Crépine à cellules de 40 μm	Fisher Scientific	22368547
Tubes coniques de 50 ml	Faucon	352098
5ml de pipettes sérologiques	Fisher Scientific	13-676-10H
Plaques de culture tissulaire de 60 mm	Faucon	353002
Crépine à cellules de 70 μm	Fisher Scientific	22363548
Perles anti-O4- Microbilles Anti-O4	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-094-543
Ensemble complet de filtre autofil, filtre 0,22 um, 250 ml	Scientifique américain	Référence 6032-1101
Ensemble complet de filtre autofil, filtre 0,22 um, 250 ml	Scientifique américain	Référence 6032-1102
Supplément B27	Invitrogen	Référence 17504-044
Sérum de croissance bovine (BGS)	GE Healthcare Sciences de la vie	SH30541.03
Bsa	Fisher Scientific	BP-1600-100
Le CNTF	Peprotech	450-50
Désoxyribonucléase I (DNAse I)	Worthington	LS002007
Edta	Fisher Scientific	S311
Scalpels jetables en plumes	Andwin Scientific	EF7281C
glucose	Fisher Scientific	D16-1
GlutaMAX	Invitrogen	Référence 35050-61
insuline	Invitrogen	Référence 12585-014
Support séparateur magnétique - MACS multistand	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-303
Séparateur magnétique-Séparateur MiniMACS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-302
Unité de filtration Millex PES 0,22 μm	Millipore	SLG033RS
Milieu neurobasal A	Invitrogen	Référence 10888-022
Papaïne	Worthington	LS003126
PBS sans Ca2+ et Mg2+	sigma	D5652
Solution mère DNase I			1. Dissoudre à 12 500 U de désoxyribonucléase I/ml dans du HBSS refroidi sur glace. 2. Filtrer la stérilisation sur glace 3. Aliquote à 200 μl et congélation pendant la nuit à -20°C. 4. Stocker les aliquotes entre -20 et -30 °C.
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (sans Ca2+ et Mg2+)			Dissoudre le sachet dans 1 litre d’eau pour obtenir 1 litre de fluide à 9,6 grammes de poudre par litre de milieu. Conserver entre 2 et 8 °C.
Trypan Blue Solution	Corning	25-900-CI
B27NBMA			487,75 mL de milieu neurobasal A ; 10 mL de supplément B27 ; 1 mL de Primocine ; 1,25 mL de glutamax ; Filtrer, stériliser et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
B27NBMA + 10 % BGS			27 mL B27NBMA ; 3 mL de sérum de croissance bovine
Solution mère CNTF (10 μg/ml ; 1000X)			Commandez chez Peprotech (450-50). Compléter à 0,1 à 1 mg/ml selon les instructions du fabricant (peut varier d'un lot à l'autre) dans un tampon (par exemple DPBS + 0,2 % BSA). Conserver à -80 °C Solution de travail (10 μg/ml, 1000X) 1. Appliquer 0,2 % de BSA (Fisher scientific BP-1600-100) dans une solution DPBS et filtrer la stérilisation. 2. Diluer l’aliquote de la mère à 10 μg/ml dans des BSA/DPBS. stériles et réfrigérés à 0,2 %. 3. Aliquote (20μl/tube) et congélation instantanée dans de l’azote liquide. 4. Stocker les aliquotes à -80 °C.
Tampon de tri magnétique des cellules (MCS)			Préparez la solution contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2 et 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,5 mM d’EDTA, 5 g/ml d’insuline, 1 g/L de glucose. Stériliser et dégazer par filtration le tampon en le faisant passer à travers un filtre Millex de 0,22 μm. Conservez le tampon à 4°C jusqu’à utilisation
Les sels équilibrés de Hank (HBSS) (Sigma			1. Mesurez 900 ml d’eau (température 15-20 °C) dans un cylindre et remuez doucement. 2. Ajoutez le pouvoir et remuez jusqu’à ce qu’il soit dissous. 3. Rincez l’emballage d’origine avec une petite quantité d’eau pour éliminer toute trace de poudre. 4. Ajoutez à la solution à l’étape 2. 5. Ajouter 0,35 gr de bicarbonate de sodium (7,5 % p/v) pour chaque litre de volume final. 6. Continuez à remuer jusqu’à ce qu’il soit dissous. 7. Ajustez le pH du tampon tout en remuant à 0,1-0,3 unité en dessous du pH = 7,4 car il peut augmenter pendant la filtration. L’utilisation de 1N HCl ou 1N NaOH est recommandée pour ajuster le pH. 8. Ajoutez de l’eau supplémentaire pour porter le volume final à 1L. 9. Stériliser par filtration à l’aide d’une membrane d’une porosité de 0,22 microns. 10. Conserver à une température comprise entre 2 et 8 °C.