Préparation d’un substrat micropatterned pour étudier les phénotypes des cellules de Schwann

Résumé

Source : Xu, Z., Orkwis, et al. Préparation de microenvironnements de matrice extracellulaire accordable pour évaluer la spécification du phénotype des cellules de Schwann. J. Vis. Exp. (2020).

La vidéo décrit la préparation d’un substrat micropatterned pour étudier la spécification du phénotype cellulaire. Un tampon PDMS à micromotifs recouverts de protéines est utilisé pour transférer le micromotif sur une lamelle recouverte de PDMS. La lamelle est ensuite traitée avec un tensioactif pour entraver l’adhérence cellulaire sur les surfaces indésirables. Les cellules sont ensuite ajoutées pour s’installer dans le motif et incubées pour une analyse plus approfondie.

Protocole

1. Préparation et caractérisation du substrat de culture cellulaire accordable

1. Préparation du support
   1. Mélangez vigoureusement l’élastomère de base de polydiméthylsiloxane (PDMS) et les agents de durcissement à l’aide d’une pointe de pipette dans un rapport compris entre 10:1 et 60:1 jusqu’à ce que les bulles soient dispersées de manière homogène dans le mélange. Éliminez les bulles à l’aide de la dessiccation sous vide jusqu’à ce qu’elles se dissipent.
      REMARQUE : Lors de la polymérisation PDMS, l'agent de durcissement se réticule avec l'élastomère de base pour fournir les propriétés mécaniques souhaitées du polymère final. Les rapports de réticulation peuvent être ajustés pour modifier la rigidité du PDMS.
   2. Placez une goutte (~0,2 mL) de mélange PDMS desséché sur une lamelle carrée ou circulaire (p. ex., 22 mm x 22 mm) et faites pivoter la lamelle sur une machine à revêtir à 2500 tr/min pendant 30 s.
   3. Incuber la lamelle dans un four à 60 °C pendant 1 à 2 h ou à température ambiante pendant la nuit pour que le PDMS se solidifie.
   4. Traitez la lamelle à l’aide d’un nettoyant UV-Ozone pendant 7 min (longueur d’onde UV : 185 nm et 254 nm) pour augmenter l’hydrophilie de surface. Placez-le dans une assiette stérilisée à 6 puits.
   5. Avant de l’utiliser pour la culture cellulaire, incubez les substrats dans de l’éthanol à 70 % pendant au moins 30 minutes.
      ATTENTION : Le nettoyant UV-Ozone peut générer de l’ozone nocif pour l’homme. Travaillez dans une hotte chimique ou avec une forme de ventilation.
2. Préparation du substrat à micromotifs
   1. Dessinez la géométrie souhaitée et les zones adhésives des cellules (900 μm², 1 600 μm² et 2 500 μm²) à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). Créez un photomasque chromé basé sur ces motifs auprès d’un fournisseur commercial.
   2. Dans une salle blanche ou un environnement sans poussière, utilisez des techniques de photolithographie standard pour fabriquer des plaquettes de silicium. Les paramètres critiques pour cette application particulière sont les suivants : Photorésine : SU-8 2010 ; Profil d’essorage pour disperser la résine photosensible : 500 tr/min pendant 10 s avec une accélération de 100 tr/min, puis 3500 tr/min pendant 30 s avec une accélération de 300 tr/min ; Énergie d’exposition à la lumière UV : 130 mJ/cm2.
      REMARQUE : La hauteur des motifs sur les plaquettes de silicium est d’environ 10 μm selon ces paramètres. Les fissures potentielles autour du bord à l’extérieur des motifs rectangulaires ou triangulaires peuvent être observées à l’aide d’un microscope optique après l’étape 1.2.2. La cuisson de la plaquette de silicium à 190 °C pendant 30 min permet d’éliminer les fissures.
   3. Placez la plaquette de silicium à motifs dans une boîte de Pétri circulaire de 150 mm de diamètre x 15 mm de hauteur et versez le PDMS dégazé (rapport de mélange 10:1) comme préparé à l’étape 1.1.1 sur la plaquette de silicium.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’épaisseur du PDMS est d’au moins 5 mm pour faciliter la manipulation lors des étapes d’impression par microcontact.
   4. Solidifiez le PDMS sur une plaquette de silicium dans un four à 60 °C pendant la nuit. Laissez le PDMS refroidir à température ambiante. Découpez avec précision des tampons carrés de 30 mm x 30 mm contenant les motifs corrects de la plaquette de silicium à l’aide d’un scalpel chirurgical. N’endommagez pas la plaquette de silicium.
      REMARQUE : Les plaquettes de silicium peuvent être réutilisées plusieurs fois à ce stade pour produire plus de tampons après le nettoyage avec de l’isopropanol.
   5. Stérilisez les tampons PDMS et les lamelles réglables (préparées aux étapes 1.1.1 à 1.1.3) en les immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes.
   6. Pour confirmer l’efficacité des micromotifs par les tampons PDMS après l’impression par microcontact, séchez la surface des tampons PDMS à l’aide d’un flux d’air filtré et pipetez une solution d’albumine sérique bovine (BSA) (conjuguée Texas Red) pour couvrir toute la face à motifs du tampon PDMS.
   7. Incuber les tampons PDMS avec une solution BSA pendant 1 h à température ambiante pour permettre l’adsorption des protéines.
   8. Séchez la surface des lamelles réglables à l’aide d’un courant d’air filtré et augmentez l’hydrophilie de surface comme décrit à l’étape 1.1.5.
   9. Faites sécher à l’air libre les tampons PDMS pour éliminer la solution BSA restante.
      REMARQUE : Veillez à ce que la solution BSA soit complètement retirée du tampon, car toute solution restante fera glisser les tampons sur la lamelle de recouvrement lors de l’impression par microcontact.
   10. Mettez le côté à motifs du tampon en contact conforme avec la lamelle amovible pour l’adsorption BSA sur la surface de la lamelle. Appuyez doucement le tampon contre la lamelle pendant 5 min.
       REMARQUE : N’appliquez pas de force excessive sur le tampon car il se plierait et provoquerait un contact non spécifique entre le tampon et la lamelle. La force appropriée appliquée au tampon est essentielle pour une impression par microcontact réussie.
   11. Examinez le micromotif à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un filtre FITC (Fluorescein isothiocyanate).
   12. Pour imprimer des zones adhésives cellulaires plutôt que des motifs fluorescents, remplacez la protéine BSA par de la laminine et répétez les étapes 1.2.5 à 1.2.10.
   13. Retirez les tampons des lamelles et transférez-les dans une plaque stérilisée à 6 puits. Ajouter 2 ml de solution de Pluronic F-127 à 0,2 % p/v dans chaque puits pour couvrir la surface de la lamelle et incuber pendant 1 h à température ambiante.
       REMARQUE : Pluronic F-127 peut être adsorbé à la surface du PDMS, ce qui augmente l’hydrophobicité de la surface du PDMS pour bloquer l’adhésion des cellules.
   14. Aspirez la solution de Pluronic F-127 et lavez-la 5 fois avec une solution saline tampon de phosphate (PBS) et 1 fois avec le milieu de culture cellulaire avant d’ensemencer les cellules. Une densité de semis typique pour les SC est de 1 000 cellules/cm².
   15. 45 min après l’ensemencement cellulaire, retirer le milieu de culture cellulaire et laver les lamelles avec du PBS 2x pour éviter que plusieurs SC n’adhèrent au même motif. Maintenir les cellules dans l’environnement de culture cellulaire souhaité pendant 48 h avant de les quantifier.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine de sérum bovin (BSA), conjugué Texas Red	Thermo Fisher Scientific	N° A23017	Coloration BSA pour montrer les micromotifs
Aigle modifié de Dulbecco Medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Milieu de culture cellulaire
Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher Scientific	16000044	Supplément de milieu de culture cellulaire
Fibronectine	Thermo Fisher Scientific	Référence 33010-018	Protéines utilisées pour enrober les lamelles
Microscope à fluorescence	Nikon	Éclipse Ti2	Microscope à fluorescence
Laminine	Thermo Fisher Scientific	23017015	Protéines utilisées pour enrober les lamelles
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122	Supplément de milieu de culture cellulaire
F-127 Pluronic	Sigma Aldrich	P-2443	Bloquer la liaison aux protéines non spécifiques
SYLGARD 184 PDMS base et agent de durcissement	Sigma Aldrich	761036	Polymère accordable utilisé pour revêtir les lamelles
Nettoyant UV-Ozone	Novascan		Augmenter l’hydrophicilité du PDMS