Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement et culture de fibroblastes de nerfs moteurs et sensoriels et de cellules SC (cellules de Schwann)
- Utilisez des rats Sprague-Dawley (SD) âgés de sept jours (n = 4) du Centre des animaux expérimentaux de l’Université de Nantong en Chine. Placez les rats dans un réservoir contenant 5 % d’isoflurane pendant 2-3 minutes, laissez les animaux respirer lentement et n’avoir aucune activité indépendante, puis désinfectez avec de l’éthanol à 75 % avant la décapitation.
- À l’aide de ciseaux, coupez la peau du dos sur environ 3 cm et retirez la colonne vertébrale. Ouvrez le canal vertébral avec précaution pour exposer la moelle épinière.
- Maintenez la moelle épinière dans une boîte de Pétri de 60 mm avec 2 à 3 ml de solution saline équilibrée D-Hanks glacée (HBSS).
- Sur la base de la structure anatomique, excisez la racine ventrale (nerf moteur) puis la racine dorsale (nerf sensoriel) au microscope à dissection. Ensuite, placez-les dans une solution saline équilibrée D-Hanks (HBSS) glacée.
- Après avoir retiré le HBSS, coupez les nerfs en morceaux de 3 à 5 mm à l’aide de ciseaux et digérez avec 1 mL de trypsine à 0,25 % (p/v) à 37 °C pendant 18 à 20 min. Ensuite, complétez avec 3-4 ml de DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) pour arrêter la digestion.
- Pipeter doucement le mélange de haut en bas une dizaine de fois et centrifuger à 800 x g pendant 5 min. Après cela, jetez le surnageant et suspendez le précipité dans 2-3 mL de DMEM complété par 10 % de FBS.
- Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’un filtre à 400 mailles, puis inoculer les cellules dans une boîte de Pétri de 60 mm et les faire cultiver à 37 °C avec 5 % de CO2. Après 4-5 jours de culture, isolez le passage 0 (p0) des fibroblastes et des SC après avoir atteint 90 % de confluence.
- Isolement et culture des CS (Figure 1)
- Lavez les cellules une fois avec 1x PBS. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % (p/v) (37 °C) par boîte de Pétri de 60 mm pour digérer les cellules pendant 8 à 10 s à température ambiante. Après cela, 3 ml de DMEM complété par 10 % de FBS ont été ajoutés pour arrêter la digestion.
- Soufflez doucement le mélange à l’aide d’une pipette pour détacher les SC. Ensuite, prélever et centrifuger les SC à 800 x g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et suspendre le résidu dans 3 mL de DMEM avec 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine, 2 μM de forskoline et 10 ng/mL de HRG, puis inoculer les cellules dans une boîte de Pétri de 60 mm non enrobée. Après une culture à 37 °C pendant 30 à 45 min, les fibroblastes (quelques fibroblastes sont digérés avec des SC) se fixent au fond de la boîte.
- Transférez le surnageant (y compris les SC) dans une autre boîte de milieu enrobée de poly-L-lysine (PLL) et cultivez à 37 °C pendant 2 jours.
