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1. Préparation de la culture endothéliale de souris dans des inserts de support perméables
REMARQUE : Les cellules BEND3 sont entretenues conformément aux instructions du fabricant.
- Préparez le milieu cellulaire BEND3 en ajoutant 50 ml de FBS et 5 ml de pénicilline-streptomycine dans 500 ml de DMEM et mélangez bien.
- Aspirez le milieu de la vaisselle et lavez une fois la culture cellulaire BEND3 avec 1 mL de PBS. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA (acide éthylène-diamine tétraacétique) à 0,25 % sur les cellules et les incuber pendant 4 min à 37 °C.
- Ajoutez 1 mL de BM dans les cellules pour neutraliser la trypsine-EDTA et pipetez doucement de haut en bas pour dissocier complètement les cellules. Transvaser la suspension cellulaire dans un nouveau tube conique de 15 mL et la pastille par centrifugation à température ambiante (RT) pendant 5 min à 400 x g.
- Aspirez le surnageant du tube et remettez les cellules en suspension avec 9 ml de BM frais, puis ajoutez 1 ml de suspension cellulaire dans un insert de support perméable. Ajouter 2 mL de BM frais par puits dans la chambre inférieure de la matrice. Continuez à cultiver les cellules pendant une journée.
2. Mise en place de la co-culture neurale-endothéliale et du système de marquage Ac4ManNAz
- Un jour, après avoir plaqué les cellules BEND3 dans les inserts, aspirez doucement le fluide dans la chambre inférieure d’abord, puis les inserts. Lavez la face des inserts 3 fois avec du DMEM préchauffé (le médium aigle modifié de Dulbecco). Lavez la surface extérieure des inserts en rinçant avec du DMEM préchauffé.
- Ajouter 1 mL de AM préchauffé (milieu adhérent) dans un insert, puis transférer les inserts dans les puits contenant des cellules corticales primaires. Incuber la co-culture à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 12 h.
- Dissoudre l’Ac4ManNAz dans du DMSO (sulfoxyde de diméthyle) pour obtenir une concentration de stock de 200 mM. 12 h après la mise en place de la co-culture neurale-endothéliale, ajouter 1 μL de stock d’Ac4ManNAz par chambre inférieure et 0,5 μL de stock par insert dans la co-culture. Secouez les assiettes immédiatement et doucement pour bien mélanger le fluide. Pour les cellules de contrôle, ajoutez un volume égal de DMSO.
- Cultivez les cellules pendant encore 5 jours à 37 °C et 5 % de CO2. Préparez le AM avec 10x bFGF comme milieu de réalimentation (RM). Pendant ce temps, ajoutez 100 μL de RM par insert et 200 μL de RM par chambre inférieure pour réalimenter les cellules endothéliales et neurales tous les deux jours. Lors de la réalimentation, ne pas introduire d’Ac4ManNAz ou de DMSO dans la culture.