Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Solutions et médicaments
- Solution saline physiologique (PSS)
- Préparez un minimum de 1 L de PSS en utilisant 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM d'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES) et 10 mM de glucose.
- Préparer les solutions nécessaires manquant de CaCl2 (zéro Ca2+ PSS) pour la dissection des artérioles cérébrales et l’isolement du tube endothélial.
note: Préparer toutes les solutions dans du H2O désionisé ultrapur, suivi d’une filtration (0,22 μm). Assurez-vous que le produit final contient un pH de 7,4 avec une osmolalité comprise entre 290 et 300 mOsm.
- Albumine sérique bovine (BSA, 10 %)
- Dissoudre 1 g de poudre de BSA lyophilisée dans un bécher de 10 mL de PSS zéro Ca2+. Couvrez le bécher et laissez au moins 2 h en remuant lentement pour que le BSA se dissolve.
- Filtrer la solution à l’aide d’une seringue de 10 mL et d’un filtre de 0,22 μm et préparer des aliquotes de 1 mL à conserver à -20 °C.
- Solution de dissection
- Ajouter 500 μL de BSA (10 %) à 49,5 mL de PSS zéro Ca2+ pour un volume total de 50 mL.
- Transférez la solution dans une boîte de Pétri pour les dissections artériolaires.
- Solution de dissociation
- Ajouter 5 μL de solution de CaCl2 (1 M) et 500 μL de BSA (10 %) à 49,5 mL de PSS zéro Ca2+ pour un volume total de 50 mL. Incuber la solution à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Enzymes
- Préparez 1 mL de solution digestive avec 100 μg/mL de papaïne, 170 μg/mL de dithioérythritol, 250 μg/mL de collagénase (mélange de type H) et 40 μg/mL d’élastase
note: Les activités enzymatiques peuvent varier, bien que les protocoles réussis nécessitent probablement les activités enzymatiques suivantes : ≥ 10 unités/mg pour la papaïne, ≥ 1 unité/mg pour la collagénase et ≥ 5 unités/mg pour l’élastase
2. Isolement des artérioles parenchymateuses
NOTE : Les artérioles provenant des artères cérébrales moyennes (ACM) et intégrées dans le parenchyme cérébral sont choisies pour ce protocole. Les artérioles sont isolées comme décrit précédemment11, avec modification.
- À l’aide de goupilles en acier (diamètre : 0,2 mm, longueur : 11 à 12 mm) pour fixer le cerveau isolé dans une solution de dissection froide dans une boîte de Pétri contenant un revêtement en polymère de silicium infusé de charbon de bois (profondeur ≥ 50 cm).
- À l’aide de ciseaux de dissection tranchants et alignés, découpez un rectangle de tissu cérébral (longueur : 5 mm, largeur : 3 mm) (Figure 1B) autour de l’ACM tout en veillant à ce que la partie supérieure du segment de tissu dépasse le point de ramification du cercle de Willis. Coupez un autre rectangle de tissu cérébral dans l’autre hémisphère du cerveau pour accéder à plus d’artérioles si nécessaire.
- Fixez le segment de tissu cérébral séparé dans la boîte avec le MCA vers le haut (distal par rapport au cercle de Willis) à l’aide de broches en acier (diamètre : 0,1 mm, longueur : 13 à 14 mm). Faites soigneusement une incision peu profonde près des broches pour retirer la pia à l’aide d’une petite pince, en décollant doucement d’une extrémité vers l’autre (Figure 1C). Retirez la pia de l’autre segment de tissu pour accéder à plus d’artérioles si nécessaire. Fixez soigneusement la pie, isolée avec des artérioles parenchymateuses ramifiées du MCA, dans la boîte avec les épingles, et disséquez les artérioles parenchymateuses (Figure 1D), en vous assurant que les artérioles ne sont pas endommagées.
note: Si les artérioles ne sont pas facilement retirées avec la pia du parenchyme, utilisez des pinces fines et creusez dans le cerveau, en commençant par le point de branche MCA du cercle de Willis. Localisez l’artériole, desserrez soigneusement le tissu autour des artérioles (Figure 1E) et retirez doucement l’artériole du parenchyme, en tenant l’extrémité supérieure de l’artériole (Figure 1F). Plusieurs artérioles (longueur : ~1,5-2 mm) peuvent être isolées à partir d’un rectangle de tissu cérébral.
- Assurez-vous que l’artériole est propre et qu’aucun tissu n’y est attaché, et coupez toutes les branches distales restantes (figure 2A). Utilisez cette artériole propre et intacte pour la digestion enzymatique. Alternativement, coupez chaque artériole en deux morceaux (longueur : 0,75-1 mm) pour la digestion enzymatique pour la préparation des tubes endothéliales si vous le souhaitez.
3. Digestion des artérioles parenchymateuses et préparation des trompes endothéliales
- Agencement du matériel et des pipettes
note: L’isolement des tubes endothéliales artériels du cerveau a été décrit précédemment13,18. Le protocole actuel intègre des modifications pour l’isolement de l’endothélium à partir des artérioles parenchymateuses (intracérébrales). Plusieurs artérioles et/ou morceaux d’artérioles peuvent être utilisés ensemble pour la digestion enzymatique.
- Assembler l’appareil de trituration13 pour la préparation des tubes endothéliales à l’aide d’une platine en aluminium supportant une chambre et des micromanipulateurs. Assemblez un microscope équipé d’objectifs (5x-60x) et une caméra connectée à un écran d’ordinateur. Fixez une microseringue à l’aide d’un contrôleur de pompe à côté de la platine et de l’échantillon.
- Fixez une pipette de trituration remplie d’huile minérale sur le piston de la microseringue. À l’aide de la microseringue avec le contrôleur de pompe, prélever la solution de dissociation dans la pipette de trituration (~130 nL) au-dessus de l’huile minérale tout en prenant soin d’éviter les bulles d’air dans la pipette.
- Digestion partielle des segments artériolaires
- Placer les segments artériolaires intacts dans 1 mL de solution de dissociation dans un tube de verre de 10 mL contenant 100 μg/mL de papaïne, 170 μg/mL de dithioérythritol, 250 μg/mL de collagénase et 40 μg/mL d’élastase. Incuber les segments artériolaires à 34 °C pendant 10 à 12 min.
- Après la digestion, remplacer la solution enzymatique par 3 à 4 ml de solution de dissociation fraîche à température ambiante.
- Isolement du tube endothélial artériolaire
REMARQUE : Après la digestion et le remplacement de la solution enzymatique, transférez un ou plusieurs segments partiellement digérés dans la solution de dissociation dans une chambre de superfusion fixée à une plate-forme mobile. Lors de l’observation à un grossissement de 100x à 200x, sélectionnez un segment de vaisseau partiellement digéré mais ininterrompu et concentrez-vous dessus au microscope.
- Placez la pipette de trituration fixée à l’injecteur de microseringue dans la solution de dissociation dans la chambre et positionnez-la près d’une extrémité du segment de récipient digéré. Réglez un débit compris entre 1 et 3 nL/s sur le contrôleur de pompe pour une trituration en douceur.
- Tout en maintenant un grossissement de 100x à 200x, prélevez le segment artériolaire dans la pipette puis éjectez-le pour dissocier les adventices et les cellules musculaires lisses (Figure 1B). Triturez le segment vasculaire jusqu’à ce que toutes les cellules musculaires lisses soient dissociées et que seules les cellules endothéliales restent sous forme de « tube » intact.
note: Si nécessaire lors de la trituration, utilisez soigneusement une pince à pointe fine pour retirer l’adventice dissociée et la lame élastique interne du tube endothélial. En règle générale, seuls quelques cycles de trituration permettent d’obtenir un tube endothélial intact.
- À l’aide de micromanipulateurs, fixez chaque extrémité du tube endothélial sur la lamelle en verre dans la chambre à l’aide de pipettes à goupillage en verre borosilicaté (figures 2C et D).
- Sécurisation de la sonde endothéliale artériolienne
- Remplacer la solution de dissociation par une solution de superfusion (PSS contenant 2 mM de CaCl2) tout en veillant à ce que le matériel non endothélial soit éliminé de la chambre.
- Transférez le tube endothélial sécurisé dans la plate-forme mobile vers le banc de microscope conçu pour la superfusion continue et les enregistrements/images intracellulaires ou fluorescents.
- Appliquer une administration continue de PSS pendant l’expérience. Régler manuellement le débit (5-7 mL/min) tout au long de l’expérience à l’aide de la soupape de régulation de débit en ligne, en cohérence avec le flux laminaire, tout en adaptant l’alimentation du débit de solution à la mesure de l’aspiration sous vide. Laisser ≥5 min de flux PSS vers la chambre pour la superfusion du tube endothélial avant d’acquérir les données de base et/ou le chargement du colorant.
