Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Dissection du disque intervertébral bovin
- Rincez abondamment toute la queue à l’eau du robinet pour éliminer la saleté et les poils à la surface.
note: Avec des extrémités distales intactes, un maximum de 9 disques intervertébraux (DIV) (coccygiens 1-9) par queue peuvent être utilisés pour les expériences en fonction de la taille souhaitée des DIV. En considérant le diamètre souhaité entre 15 et 20 mm, nous avons utilisé 12 queues de bovins avec 5 IVD par queue pour les expériences.
- Plongez toute la queue dans une boîte contenant une solution de bétadine à 1 % pendant 10 min. Séchez brièvement la queue avec de la gaze stérile et placez-la sur un rideau stérile.
note: Pendant la dissection du disque, humidifiez les queues avec de la gaze mouillée avec la solution de Ringer pour éviter la déshydratation. Conservez les queues (ou les segments restants) enveloppées dans de la gaze humide jusqu’à ce que toute la procédure de dissection soit terminée.
- À l’aide d’un scalpel (n° 20), retirer le plus complètement possible les tissus mous de la colonne caudale afin de faciliter l’identification des DIV. Retirez les apophyses épineuses et transversales des vertèbres à l’aide d’une pince pour enlever les os.
note: Sélectionnez des DIV ayant le diamètre souhaité. Des DIV d’un diamètre de 15 à 20 mm ont été utilisés dans la présente étude.
- Coupez transversalement avec une pince à os au milieu de chaque corps vertébral pour obtenir des segments de mouvement individuels. Mettez les segments de mouvement dans une boîte de Pétri avec de la gaze imbibée de solution de Ringer.
- Localisez l’IVD et la vertèbre par palpation et en déplaçant doucement les segments de mouvement. Faites deux coupes parallèles avec la scie à ruban dans la plaque de croissance des IVD, une de chaque côté de l’IVD. Identifiez l’emplacement de la plaque de croissance en touchant et en trouvant le site convexe de la partie osseuse de la plaque d’extrémité (dure) adjacente au disque (molle) avec une distance de sécurité d’environ 0,5 à 1 mm entre le DIV et la vertèbre. Assurez-vous que la lame de la scie à ruban est refroidie avec la solution de Ringer pendant la coupe des vertèbres.
- Transférez les DIV dans une boîte de Pétri propre avec de la gaze propre imbibée de solution de Ringer.
note: La gaze doit être humidifiée et pas trop humide pour éviter le gonflement des IVD,
- Utilisez la lame du scalpel pour gratter le corps vertébral (os rouge/rose), la plaque de croissance (cartilage blanc), laissez la plaque d’extrémité intacte (jaune-rose). Faites en sorte que les deux surfaces soient planes et parallèles pour la procédure de chargement. Transférez les IVD grattés dans une boîte de Pétri fraîche avec de la gaze imbibée de solution de Ringer.
note: Portez un gant en cotte de mailles pour protéger la main tout en tenant l’IVD et en grattant.
- Mesurez la hauteur et le diamètre du disque à l’aide d’un pied à coulisse. Nettoyez les caillots sanguins dans l'os des vertèbres avec la solution de Ringer à l'aide d'un système de lavage par jet.
- Transférez les DIV dans des tubes en plastique de 50 ml, à raison d’un DIV par tube. Ajouter 25 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 10 % de pénicilline/streptomycine (P/S) par IVD et laisser agiter pendant 15 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante.
- Aspirez le surnageant et ajoutez 10 mL de PBS + 1 % P/S par DIV pendant 2 minutes pour rincer les DIV.
2. Culture et chargement IVD
- Transférez les disques dans les chambres de DIV et ajoutez du milieu de culture de DIV (milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L de DMEM à haute teneur en glucose pour le groupe physiologique et 2 g/L de DMEM à faible teneur en glucose pour le groupe pathologique) + 1 % P/S + 2 % de sérum de veau fœtal + 1 % d'ITS (contient 5 μg/mL d'insuline, 6 μg/mL de transferrine, et 5 ng/mL d’acide sélénieux) + 50 μg/mL d’ascorbate-2-phosphate + 1 % d’acide aminé non essentiel + 50 μg/mL d’agent antimicrobien pour les cellules primaires) et placer dans un incubateur à 37 °C, 85 % d’humidité et 5 % de CO2.
- Cultivez les disques pendant 4 jours dans un système de bioréacteur selon les groupes expérimentaux. Dans le groupe pathologique, maintenir les conditions de charge dégénérative à 0,32-0,5 MPa, 5 Hz pendant 2 h/jour. Dans le groupe témoin physiologique, utiliser un protocole de charge de 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz pendant 2 h/jour.
note: Placez les DIV dans des chambres contenant 5 ml de milieu de DIV pendant les procédures de chargement. Le volume dépend de la taille des chambres de chargement du bioréacteur. Entre les procédures de chargement, placez les DIV dans des plaques à six puits avec 7 ml de milieu de culture IVD pour la récupération de l’enflure libre.
- Pour analyser les changements de hauteur du disque pendant la période expérimentale, mesurez la hauteur du disque avec un pied à coulisse après la dissection IVD (ligne de base), puis quotidiennement après la période de gonflement libre et après la charge dynamique pendant la durée de l’expérience.
