Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines dans les neurones à l’aide de lentivirus modifiés

Abstract

Source : Assetta, B., et al., Génération de neurones humains et d’oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes pour la modélisation des interactions neurones-oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo démontre le processus d’induction de cellules souches pluripotentes humaines à se différencier en neurones en les transfectant avec des lentivirus modifiés portant un gène de facteur de transcription neurogène sous le contrôle d’un élément sensible à la tétracycline, suivi d’un traitement avec un dérivé de la tétracycline et un milieu de maturation.

Protocol

1. Induction de neurones humains à partir de cellules souches pluripotentes humaines

1. Préparation du lentivirus (~5 jours, protocole détaillé comme décrit précédemment)
   1. Plaquez ~1 million de cellules HEK293T dans chaque fiole T75 pour qu’elles soient confluentes à ~40 % lors de la transfection. Transfectez-les avec des plasmides exprimant le gène Ngn2 inductible par la tétracycline et le gène résistant à la puromycine (PuroR ; sous le même contrôle du promoteur TetO), rtTA et les trois plasmides auxiliaires pRSV-REV, pMDLg/pRRE et VSV-G (12 μg d’ADN du vecteur lentiviral et 6 μg de chacun de l’ADN plasmidique auxiliaire). Préparez au moins trois flacons par préparation de lentivirus. Utilisez le PEI pour la transfection en suivant les instructions du fabricant. Changez le support après 16 h et jetez-le.
   2. Récoltez les particules virales libérées en recueillant des milieux de culture tous les jours et remplacez-les par des milieux frais pendant 3 jours. Regrouper les milieux collectés contenant des particules virales pour la purification. Filtrer le virus à travers un filtre de 0,22 μm et centrifuger à 49 000 x g pendant 90 min. Remettre la pastille en suspension dans le volume approprié de PBS-glucose (~150 μL).
2. Induction neuronale (~5 jours)
   note: Ce protocole d’induction (Figure 1A ; diagramme de flux) est très efficace pour les cellules iPS et ES de pluripotence validée (qui peuvent être dosées par coloration immunohistochimique de marqueurs de pluripotence bien caractérisés ; Figure 1B).
   1. Utiliser des cellules ES humaines H1 disponibles dans le commerce au passage de 52 (voir le tableau des matériaux). Cultivez les cellules sur des plaques à 6 puits recouvertes d’une solution de matrice extracellulaire (~0,5 mg de solution matricielle par plaque à 6 puits ; voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un milieu de maintenance cellulaire ES (voir le tableau des matériaux) et incubez les plaques à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   2. Le jour -2, détacher les cellules ES (80 % confluentes) avec 1 mL de solution de décollement cellulaire (voir le tableau des matériaux) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Transvaser les cellules dans un tube ; laver le puits avec 2 mL de milieu et combiner dans le même tube. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, remettre la pastille en suspension dans le milieu et déposer les cellules sur des plaques à 6 puits recouvertes de matrice à la densité d’ensemencement de 1 x 10₅ cellules par puits.
   3. Au jour -1, ajouter les lentivirus exprimant Ngn2 plus PuroR et rtTA avec du polybrène (8 μg/ml) aux cellules ES dans un milieu frais d’entretien des cellules ES (voir le tableau des matériaux). La quantité exacte de virus doit être déterminée par les titres réels ou le titrage. Nous ajoutons généralement 5 μL par virus par puits dans une plaque à 6 puits.
   4. Le jour 0, ajouter de la doxycycline (2 μg/mL pour activer l’expression de Ngn2) dans un milieu DMEM-F12 avec un supplément de N2 sans morphogènes.
   5. Le jour 1, ajouter Puromycine dans un milieu frais de DMEM-F12 plus N2 et de doxycycline, jusqu’à la concentration finale de 1 μg/mL de milieu. Sélectionner les cellules transduites dans Puromycine pendant au moins 24 h. Une concentration plus élevée de Puromycine (jusqu’à 5 μg/mL) et une période de sélection plus longue (jusqu’à 48 h) peuvent être nécessaires pour éliminer adéquatement les cellules sous-transduites si le titre de virus est faible.
   6. Le jour 2, détachez les neurones différenciateurs avec une solution de détachement cellulaire (voir le tableau des matériaux), replaquez-les sur des plaques à 24 puits (entre 80 000 et 200 000 cellules/puits) recouvertes d’une solution matricielle (voir le tableau des matériaux) et maintenez-les dans un milieu NBA/B27 sans doxycycline. La densité de semis est cruciale.
   7. À ce stade, les neurones détachés peuvent être congelés dans un milieu de congélation commercial spécialisé (voir le tableau des matériaux) et stockés dans de l’azote liquide jusqu’à 3 mois. Les neurones purs peuvent être mis en boîte, ce qui représente la mort cellulaire typique de ~15 % à 20 % après la décongélation, cultivés seuls ou co-cultivés avec d’autres types de cellules cérébrales.
   8. Cultivez des iN purs sur des plaques recouvertes de solutions à base de matrice extracellulaire selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). La morphologie pyramidale caractéristique devrait être apparente au jour 4 (et au jour 6 ; Figure 1C). La formation des synapses peut être détectée dès le 14e au 16e jour et est proéminente au 24e jour par coloration immunohistochimique avec des marqueurs pré- et post-synaptiques standard. (Figure 1D ; étiqueté avec le marqueur pré-synaptique Synapsine 1 et le marqueur dendritique Map2).

Results

Figure 1 : Génération directe de neurones induits par l’homme (iN) à partir de hPSC. (A) Organigramme de la génération d’iN. (B) Images représentatives en fond clair et en immunofluorescence de la culture initiale de cellules souches pluripotentes humaines (H1) pour confirmer la pluripotence. Oct4 est montré en rouge et Sox2 en vert. (C) Im...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	Technologies STEMCELL	Référence 7920
Supplément B27	ThermoFisher	17504044
DMEM/F12 moyen	Technologies STEMCELL	Référence 36254
Dmso	ThermoFisher	D12345
Doxycycline	MilliporeSigma	D3072
H1 cellules ES humaines	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Technologies STEMCELL	Référence 5825
Supplément N2	ThermoFisher	17502001
Neurobasale A moyenne	ThermoFisher	Référence 10888-022
Acides aminés non essentiels	ThermoFisher	Référence 11140-050
Pei	VWR	Référence 71002-812
pMDLg/pRRE	Addgene	Référence 12251
Polybrène	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	Référence 12253
Puromycine	ThermoFisher	A1113803
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media	Technologies STEMCELL	Référence 5838
Kit d’induction neuronale STEMdiff SMADi	Technologies STEMCELL	Référence 8581
Tempo-iOlogo : OPCs humains dérivés d’iPSC	Tempo BioScience	Réf.102
TetO-NG2-Puro	Addgene	Référence 52047
VSV-G	Addgene	Référence 12259