Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en une population de neurones en réseau

Abstract

Source : Hubbard, K. et al., Évaluation fonctionnelle des neurotoxines biologiques dans des cultures en réseau de neurones du système nerveux central dérivés de cellules souches.J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo démontre une technique de différenciation des cellules souches embryonnaires en une population en réseau de neurones avec des synapses fonctionnelles. Il décrit les étapes impliquées dans la différenciation des cellules souches embryonnaires en neurones, l’induction de la formation du réseau neuronal et l’enrichissement de la culture avec des neurones en réseau.

Protocol

1. Différenciation neuronale

REMARQUE : Effectuez les étapes 1.1 à 1.5 avant midi et l’étape 1.7 après midi. La figure 1A présente un aperçu des procédures de différenciation.

1. Transvaser 350 μl (3,5 x 10⁶) d’ESC dans une boîte de 10 cm à faible fixation contenant 25 ml de milieu de différenciation. Placer sur un agitateur orbital réglé à 30 - 45 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂. C’est le premier jour de différenciation, appelé jour in vitro (DIV) -8.
   note: L’utilisation d’une boîte de Pétri à très faible fixation augmente le coût de la méthode, mais produit des rendements légèrement supérieurs à ceux des boîtes de Pétri bactériennes, car les agrégats peuvent parfois adhérer aux boîtes de Pétri. Si vous préférez différentes tailles de paraboles, les volumes moyens et les numéros de cellules peuvent être mis à l’échelle en conséquence.
2. Après 48 heures (DIV -6), à l’aide d’une pipette de 25 ml, transférer les agrégats cellulaires différenciateurs dans un tube conique de 50 ml. Ajouter immédiatement 25 ml de milieu de différenciation frais dans la boîte de Pétri.
3. Laisser les agrégats se déposer pendant 2 à 5 minutes, produisant une pastille visible de 1 à 2 mm de profondeur. Ignorez les cellules simples ou les petits agrégats restant en suspension. Aspirez soigneusement le milieu et transférez la pastille cellulaire dans la boîte de Pétri à l’aide d’un P1000. Placer sur un agitateur rotatif dans un incubateur de culture tissulaire.
4. À DIV -4, répétez l’étape 1.2. Le granulé aura une profondeur de 2 à 4 mm. Remplacer 30 ml de milieu de différenciation complété par 6 μM d’acide rétinoïque trans (AR) dans la boîte de Pétri. Retournez dans l’agitateur rotatif de l’incubateur de culture tissulaire pendant 48 heures supplémentaires.
5. À DIV -2, répétez l’étape 1.3. La granule aura une profondeur de 4 à 8 mm à ce stade.
6. Au DIV -1, préparer les surfaces de placage comme dans la section 2.
7. À la DIV 0, décongeler 5 ml de milieu de trypsinisation de NPC pré-aliquote et congelé à 37 °C pendant 5 à 10 min et placer dans une hotte de culture tissulaire. À l’aide d’une pipette de 25 ml, transférez les agrégats différenciateurs dans un tube conique de 50 ml. Laissez les agrégats se déposer et aspirez soigneusement le fluide. Lavez le granulé deux fois avec 10 ml de PBS, en laissant les agrégats se déposer entre les lavages.
8. Après le deuxième lavage PBS, ajoutez 5 ml de milieu de trypsinisation NPC à la pastille et incubez à 37 °C pendant 5 min. Retournez doucement le tube après 2,5 min.
9. Ajouter 5 ml d’inhibiteur de la trypsine de soja (IST) à 0,1 % pour inactiver la trypsine et mélanger en inversant. Triturer doucement 10 à 15 fois avec une pipette sérologique de 10 ml jusqu’à ce qu’une suspension cellulaire relativement homogène soit produite.
10. Transférez lentement la suspension cellulaire dans une crépine cellulaire de 40 μm ou 70 μm placée sur le dessus d’un tube conique de 50 ml. Une fois que toute la suspension a été filtrée, ajoutez 1 ml de milieu N2 pour laver les cellules restantes à travers le filtre et granulez la suspension cellulaire dissociée pendant 6 min à 200 x g.
11. Aspirer le milieu sans perturber le granulé. Laver les cellules deux fois avec 10 ml de milieu N2, granuler les cellules pendant 5 min à 200 x g et triturer entre les lavages avec un P1000. Avant le deuxième lavage, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
12. Mettre les cellules en suspension dans un milieu N2 à raison de 1 x 10,⁷ cellules par ml et des NSE sur plaque à une densité cellulaire de 150 000 à 200 000 cellules/^cm2.
13. Transvaser les NSE nouvellement placés dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ et les maintenir comme indiqué à la section 3.

2. Préparation des surfaces de culture pour le placage des précurseurs neuronaux au DIV 0

1. Préparez des plats traités pour la culture tissulaire au moins 1 jour avant le placage. Ajouter suffisamment de polyéthylèneimine (PEI ; 25 μg/ml dans le H₂O stérile) ou de poly-D-lysine (PDL ; 100 μg/ml dans le H₂O stérile) pour couvrir les boîtes en plastique traitées par culture tissulaire et incuber O/N à 37 °C.
2. Le matin du placage, laver la vaisselle deux fois avec du H₂O bidistillé et une fois avec du PBS. Après le lavage final, ajoutez suffisamment de milieu N2 pour couvrir le plat (par exemple, 1 ml par puits d’un plat à 12 puits ou 4 ml par plat de 6 cm).
3. Préparez des lamelles en verre de 18 mm au moins un jour avant le placage des neurones. Nettoyez les lamelles par nettoyage au plasma pendant 4 min.
4. Transférez immédiatement les lamelles nettoyées dans un parafilm lavé à l’éthanol au fond d’une grande boîte stérile et ajoutez 400 μl de solution de PEI ou de PDL, préparée comme à l’étape 2.1. Incuber O/N à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire.
5. Le matin, laver les lamelles trois fois avec de l’eau et ajouter 5 μg/ml de laminine dans du PBS pendant 1 à 3 heures à 37 °C. Avant de dissocier les neurones, aspirez la laminine et transférez immédiatement la lamelle dans un puits d’une boîte à 12 puits contenant 1 ml de milieu NPC, en veillant à garder le côté traité vers le haut.
6. Conservez la vaisselle et les lamelles à 37 °C jusqu’à ce que les PNJ soient prêts à servir.

3. Maintenance des neurones

1. Au DIV 1, aspirer le milieu et le remplacer par le milieu de culture N2.
2. Aux DIV 2 et 4, aspirer le milieu et le remplacer par du milieu de culture B27.
3. À la DIV 8, aspirer le milieu et le remplacer par un milieu de culture B27 contenant des inhibiteurs mitotiques pour éliminer les cellules non neuronales contaminantes.
4. À la DIV 12, remplacer par un milieu de culture B27.
5. Ne retirez pas les NSE DIV 12⁺ de 5 % de CO₂ jusqu’au moment de l’utiliser.

Results

Graphique 1. Les ESN adaptés à la suspension restent mitotiquement stables et expriment des marqueurs de pluripotence.A) Schéma de maintenance et de différenciation de l’ESC. La présence ou l’absence d’acide rétinoïque (PR) ou de facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) est marquée par un + ou un –. Une comparaison entre les jours in vitro (DIV) et les stades de dévelo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM KO	Technologies de la vie	Référence 10829-018	Milieu : milieu de culture ESC Formulation et notes : 500 mL
100x MEM NEAA	Technologies de la vie	Référence 11140-050	Milieu : conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois Formulation et notes : 6 mL
200 mM de L-alanyl-L-glutamine	ATCC	30-2115	6 mL
Qualifié ES FBS	Cellules souches appliquées	ASM-5007	90 ml
100x antibiotiques	Sigma-Aldrich	A5955	3 ml
55 mM de 2-mercaptoéthanol	Technologies de la vie	Référence 21985-023	1,1 mL
107 unités/mL LIF	Millipore	ESG1107	60 μL
DMEM KO	Technologies de la vie	Référence 10829-018	Milieu : Milieu de différenciation ESC Formulation et notes : 436,6 mL
100x MEM NEAA	Technologies de la vie	Référence 11140-050	Milieu : conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois Formulation et notes : 5 mL
200 mM de L-alanyl-L-glutamine	ATCC	30-2115	5 mL
Sérum qualifié ESC	Cellules souches appliquées	ASM-5007	50 ml
100x antibiotiques	Sigma-Aldrich	A5955	2,5 ml
55 mM de 2-mercaptoéthanol	Technologies de la vie	Référence 21985-023	0,9 mL
Le PBS de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Milieu : Milieu de trypsinisation NPC Formulation et notes : 100 mL
0,5 M EDTA (18,3 %)	Sigma-Aldrich	Référence 3690	Milieu : congeler dans 5 mL d’aliquote Formulation et notes : 0,266 mL
trypsine	Sigma-Aldrich	Réf. T8802	50 mg
Polyéthylèneimine (PEI)	Sigma-Aldrich	Réf. P3143	Média : Solutions de revêtement de surface Formulation et notes : 2,5 μg/mL dans H20
Poly-D-lysine (PDL)	Sigma-Aldrich	P7280	Milieu : à utiliser dans un délai de 1 semaine Formulation et notes : 100 μg/mL dans H20
Laminine	Sigma-Aldrich	L2020	5 μg/mL dans H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Technologies de la vie	Référence 10565-018	Milieu : Milieu de culture NPC Formulation et notes : 492,5 mL
100x vitamines N2	Technologies de la vie	Référence 17502-048	Milieu : conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois Formulation et notes : 5 mL
100x antibiotiques	Sigma-Aldrich	A5955	2,5 ml
Neurobasale A	Technologies de la vie	Référence 10888-022	Milieu : milieu de culture ESN Formulation et notes : 482,5 mL
50x vitamines B27	Technologies de la vie	Référence 17504-044	Milieu : conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois Formulation et notes : 10 mL
200 mM de L-alanyl-L-glutamine	ATCC	30-2115	5 mL
100x antibiotiques	Sigma-Aldrich	A5955	2,5 ml
5-fluoro-2'-désoxyuridine (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Milieu : 2000x Inhibiteurs mitotiques aliquote et conserver à -20 °C Formulation et notes : jd 150 mg 5FDU et 350 mg d’uridine à 10 mL Neurobasal A. Filtre stérile, aliquote et congélation. Utiliser 2000x dans le milieu de culture ESN.
uridine	Sigma-Aldrich	Référence U3003
TrypLE Express Trypsine	Technologies de la vie	Référence 12605-010	Supports : Divers Formulation et notes : en magasin chez RT
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	magasin chez RT
inhibiteur de la trypsine de soja (ITS)	Sigma-Aldrich	Réf. T6414	conserver à -20 °C
éthanol	Sigma-Aldrich	E7023	magasin chez RT
acide ascorbique	Sigma-Aldrich	A4403	Préparez un bouillon de 100 mM en dissolvant 100 mg d’acide ascorbique dans 5,7 mL d’un mélange 50:50 de DMSO et d’éthanol.
acide rétinoïque (AR)	Sigma-Aldrich	R2625	Mettre à nouveau en suspension 15 mg d’AR dans 9 mL de DMSO 50:50/éthanol. Complétez avec 1 ml de bouillon d’acide ascorbique de 100 mM. Aliquote et stocké à -80 °C. Stable pendant 6 mois.
Nettoyeur plasma	Plasma de Harrick	PDC-32G
Microscope inversé Olympus IX51	Olympe	n/a
Lamelles en verre de 18 mm	pêcheur	Tél. : 12-545-84
Crépine de cellules (40 μm)	pêcheur	Référence 08-771-1
Stovall Danseuse du Ventre Shaker	pêcheur	Tél. : 15-453-211
Plats à faible adhérence	pêcheur	Tél. : 05-539-101	Corning 3262
Boîtes bactériennes	VWR	Référence 25384-302	100 x 15 millimètre