Séparation magnétique des cellules de Schwann des nerfs sciatiques de souris

Résumé

Source : Blusch, A., et al., Myélinisation in vitro des axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglion de la racine dorsale du rat et de cellules de Schwann. J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo montre une méthode pour isoler les cellules de Schwann des fibres du nerf sciatique de souris.

Protocole

1. Culture cellulaire de Schwann

1. Revêtement pour la culture cellulaire Schwann
   1. Enduire les boîtes de culture cellulaire dans des conditions stériles. Appliquer 2 mL de poly-L-lysine (PLL) à 0,01 % dans deux boîtes de culture tissulaire (TC) de 60 mm chacune et incuber toute la nuit à 4 °C.
   2. Retirez la PLL, lavez la vaisselle TC 2 fois avec de l’eau distillée et incubez avec 2 ml de laminine 1 μg/cm² pendant la nuit à 4 °C. Lavez la vaisselle TC 2 fois avec de l’aqua dest et laissez les assiettes sécher à l’air.
2. Préparation du milieu pour la culture cellulaire de Schwann
   1. Préparez 50 ml de milieu cellulaire Schwann en ajoutant 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 2 μM de forskoline, 10 nM de neuréguline et 50 μg/mL de gentamycine à du milieu modifié d’Eagle de Dulbecco (DMEM)/F-12 (glycémie élevée) dans des conditions stériles.
   2. Préparez 70 mL de milieu L-15 de Leibovitz avec 50 μg/mL de gentamycine dans des conditions stériles.
3. Digestion enzymatique du nerf sciatique
   REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions stériles.
   1. Préparez la solution de digestion enzymatique contenant 0,25 % de dispase II, 0,05 % de collagénase de type I et 50 μg/mL de gentamycine dans 10 mL de DMEM (hyperglucose).
   2. Centrifuger le tube à 188 x g pendant 5 min à 4 °C, prélever le surnageant à l'aide d'une pipette sérologique de 25 mL et transférer la pastille avec le milieu L-15 de Leibovitz restant dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm à l'aide d'une pipette de 1 000 mL.
   3. Rincez le tube de 50 ml avec 10 ml de la solution de digestion enzymatique et ajoutez-le dans le plat contenant les fibres nerveuses. Répartissez soigneusement le tissu dans le plat avec la pointe d’une pipette pour maximiser la surface accessible pour la digestion.
   4. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 18 h, et arrêter la digestion en ajoutant 10 ml de FCS à 40 % dans la solution saline équilibrée de Hanks, sans Ca²⁺ et Mg²⁺ (HBSS).
4. Séparation cellulaire
   1. Transvaser les nerfs digérés dans un tube de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique et d’une centrifugeuse à 188 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de DMEM contenant 10 % de FCS et 50 μg/mL de gentamycine. Remettez la pastille en suspension 20 fois par la suite, à l’aide d’une pointe de pipette de 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL et 200 μL.
   2. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 100 μm et centrifuger à 188 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 4 mL de DMEM contenant 10 % de FCS et 50 μg/mL de gentamycine.
   3. Ajouter 2 mL de suspension cellulaire dans chacune des deux boîtes TC de 60 mm recouvertes de PLL et de laminine, et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂. Laissez les plaques intactes pendant 2 jours dans l’incubateur pour protéger les cellules du stress mécanique et favoriser l’adhérence.
5. Différenciation des cellules de Schwann
   1. Après 2 jours, retirez le milieu et rincez soigneusement les plaques 2 fois avec du DMEM (glucose élevé), 10 % de FCS et 50 μg/mL de gentamycine. Ensuite, ajoutez 2 ml de milieu cellulaire Schwann. Remplacez le milieu cellulaire Schwann tous les 2 jours et observez l’apparence et la confluence des cellules à l’aide d’un microscope.
6. Trypsinisation cellulaire et séparation magnétique
   1. Lorsque les cellules atteignent une confluence d’environ 80 % (6 à 12 jours de culture), laver soigneusement les plaques 2 fois avec 3 mL de DPBS et incuber avec 2 mL de trypsine/EDTA à 0,05 % (préchauffé à 37 °C) pendant 3 min. Lorsque les cellules se détachent du fond de la plaque, inactiver la digestion par l’ajout de 2 mL de DMEM avec 10 % de FCS et 50 μg/mL de gentamycine.
      note: Respectez un temps de trypsinisation de strictement 3 min, et procédez rapidement par la suite.
   2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de tampon magnétique de séparation cellulaire contenant du DPBS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 nM d’EDTA. Combinez 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu de trypan et comptez les cellules à l’aide d’une chambre de coloration.
   3. Centrifuger la suspension cellulaire à 188 x g pendant 10 min à 4 °C et remettre la pastille cellulaire en suspension dans 90 μL de tampon magnétique de séparation cellulaire par 1 x 10⁷ cellules. Ajouter 10 μL de microbilles Thy-1 par 1 x 10⁷ cellules. Remettez la solution en suspension plusieurs fois et incubez pendant 15 min à l’obscurité à 8 °C.
   4. Ajouter 2 mL de tampon de séparation cellulaire magnétique dans la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon de séparation cellulaire magnétique.
   5. Humidifiez la colonne de séparation magnétique des cellules avec 1 mL de tampon de séparation magnétique des cellules. Placez la colonne de séparation de cellules magnétiques dans le séparateur de cellules magnétiques. Appliquez les cellules sur la colonne de séparation magnétique des cellules. Recueillir le débit et centrifuger à 300 x g à 4 °C pendant 10 min
      note: Les fibroblastes sont sélectionnés positivement et restent dans la colonne, tandis que les cellules de Schwann passent par la colonne. Les fibroblastes peuvent être collectés à l’aide d’un tampon (par exemple, en tant que contrôle négatif pour les protocoles de coloration des cellules de Schwann).
   6. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu de coculture. Comptez les cellules après la coloration avec du bleu de trypan et une chambre de coloration.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine	Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne	Référence 8076.4
Crépine de cellule, 100 μM	BD Bioscience, Heidelberg, Allemagne	Référence 352360
Centrifugeuse 5810-R	Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne	5811000015
Incubateur CO2 Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Allemagne	51017865
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne	4942078001
Eau distillée (système de purification de l’eau)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne	31331093
DPBS (sans ions calcium et sans ions magnésium)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne	D8537-6X500ML
Fcs	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne	F7524	Le FCS doit être testé pour la culture cellulaire de Schwann
La gentamycine	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne	5710064
HBSS (sans ions calcium et sans ions magnésium)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne	14170138
Laminine	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne	L2020-1MG
Socle multicouche MACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne	130042303
Microciseaux	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne	Référence 15000-08
microscope	Motic, Wetzlar, Allemagne	Motic BA 400
Lame de microscope	VWR, Radnor, États-Unis	630-1985
Séparateur MiniMACS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne	130091632
Colonnes MS	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne	Référence : 130-042-201
Chambre de comptage Neubauer	Assistante, Erlangen, Allemagne	Référence 40441
Pipettes	Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne	2231300004
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne	P4707-50ML
Pipette sérologique, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne	861254025
Pipette sérologique, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne	861685001
Pipette sérologique, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne	861253001
Antenne TC 60, cellule +	Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne	833901300
Microbilles Thy-1 (kit MACS)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne	Tél. : 130-094-523
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne	Référence 25300-054
Collagénase de type I	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Allemagne	Vers 1639
Bain-marie type 1008	GFL, Burgwedel, Allemagne	4285