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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation d’une solution de tranches à haute teneur en saccharose et de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
- Avant la journée expérimentale
- Préparer 1 L de présolution en tranches 10 avec de l’eau de laboratoire de type 1 contenant (en mM) : 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (tableau 1). Afin d’éviter la précipitation de phosphate de calcium, mélangez lentement les produits chimiques dans un bécher pré-rempli de 800 mL H2O tout en remuant constamment avec un agitateur magnétique. Conservez la solution à 4 °C ou à température ambiante (RT).
- Lors de la journée expérimentale
- Préparer 1 L de 1x ACSF avec de l’eau de laboratoire de type 1 contenant (en mM) : 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 glucose (tableau 2). Utilisez un osmomètre à pression de vapeur pour valider l’osmolarité entre 305 et 315 mOsm (pH ~ 7,55 à 7,6).
note: Afin d’éviter la précipitation du phosphate de calcium, mélangez lentement tous les produits chimiques solides dans un bécher pré-rempli de 800 mL de H2O tout en remuant constamment avec un agitateur magnétique. Ajouter du MgSO4 et du CaCl2 à la toute fin, en goutte à goutte lentement la quantité nécessaire de solutions mères de 1 M.
- Buller en continu 1x solution ACSF à RT avec du carbogène pour régler le pH entre 7,3 et 7,4.
note: Si le pH est légèrement trop élevé ou trop bas, de petits ajustements de la force de carbogénation seraient suffisants. Si le pH est supérieur à 7,45 avec carbogénation, ajustez-le en ajoutant quelques gouttes de solution 1 M NaH2PO4.
- Préparer 250 mL (par cerveau) de 1 solution de tranches à haute teneur en saccharose dans un bécher contenant 25 mL de 10 présolutions de tranches et (en mM) : 252 de saccharose, 26 de NaHCO3 et 10 de glucose (tableau 3). Vérifiez que l’osmolarité est comprise entre 320 et 325 mOsm (pH ~ 7,55 et 7,6).
- Faites buliser la solution de tranches à haute teneur en saccharose pendant 10 à 15 minutes avec du carbogène pour contrôler le pH entre 7,3 et 7,4.
note: Si le pH est supérieur à 7,45 avec carbogénation, ajustez-le en ajoutant quelques gouttes de solution 1 M KH2PO4.
- Conservez la solution de tranche à haute teneur en saccharose pendant 20 à 30 minutes au congélateur ultra (-80 °C) jusqu’à ce qu’elle soit partiellement congelée.
2. Dissection et positionnement du cerveau murin
- Transférez le cerveau dans la boîte de culture réfrigérée de 35 mm et retirez tous les cheveux ou les particules de sang du tissu en lavant doucement le cerveau avec une pipette Pasteur remplie d’ACSF (le sang a des effets cytotoxiques sur le tissu cérébral).
- Transférez le cerveau à l’aide de la spatule sur le papier filtre imbibé sur le dessus de la boîte de culture réfrigérée de 90 mm (Figure 1A).
- À l’aide d’une lame, coupez le cerveau en deux, en séparant les deux hémisphères, et placez les deux hémisphères sur le côté médial fraîchement coupé.
- À l’aide d’une lame, retirez la partie dorsale (5 à 10 %) du cerveau de chaque hémisphère en effectuant une coupe parallèle au sommet dorsal (figure 1C) et placez les deux hémisphères du côté fraîchement coupé avec la partie ventrale du cerveau vers le haut.
- Placez une goutte de super colle sur la plaque d’échantillon et étalez-la correctement avec une pointe de pipette pour accueillir les deux hémisphères.
- Utilisez une sangle en papier filtre pour prélever un hémisphère avec des forces capillaires en touchant la face ventrale avec la sangle en papier filtre, évitant ainsi d’endommager les tissus.
- À l’aide d’une autre sangle de papier filtre, faites demi-sécher soigneusement la face dorsale du cerveau avant de positionner l’hémisphère, côté dorsal vers le bas, sur la colle sur la plaque d’échantillon. Répétez la même procédure avec le deuxième hemisphere.
note: Les hémisphères doivent être positionnés horizontalement en miroir sur la plaque de vibratome, les côtés rostrals pointant vers l’extérieur et les côtés caudaux se faisant face (mais ne se touchant pas) au milieu. Les côtés médiaux des deux hémisphères doivent pointer vers la lame du vibratome et les côtés latéraux vers l’expérimentateur (Figure 1D).
- Placez la plaque d’échantillon dans la chambre de tranchage et couvrez-la rapidement, mais soigneusement, d’une solution de tranche glacée à haute teneur en saccharose. Dès que la solution touche la colle, elle se solidifie et colle correctement les hémisphères à la plaque d’échantillon.
- Assurez-vous que les hémisphères sont correctement recouverts d’une solution de tranche à haute teneur en saccharose et confirmez que la solution est remplie de carbogène.
note: L’ensemble de la procédure de dissection doit être effectué le plus rapidement possible. Veuillez vous assurer que le cerveau ne reste pas sans apport d’oxygène pendant une très longue période. Il ne devrait s’écouler qu’environ 1 à 1,5 minute entre la décapitation et l’immersion du cerveau dans la gadoue de solution de tranche à haute teneur en saccharose. Il s’agit de l’exigence la plus critique pour les préparations de coupes cérébrales aiguës afin de garantir une qualité élevée de la tranche.
3. Découpage horizontal du cerveau
- Positionnez la lame du vibratome devant la face médiale des hémisphères et abaissez-la à la même hauteur que les faces ventrales des hémisphères qui sont maintenant tournées vers le haut. Abaissez la lame à l’aide de la commande du vibratome à 600 μm plus loin dans le sens dorsal et commencez à trancher. La lame doit toucher le tissu (sinon, inversez la lame et abaissez-la un peu plus). Coupez en tranches jusqu’à ce que les deux premières tranches soient complètement séparées des deux hémisphères.
- Inversez la lame et abaissez-la encore de 300 μm et coupez à nouveau.
- Lorsque l’hippocampe devient visible (utilisez l’atlas du cerveau de souris pour vous aider, si nécessaire) (Figure 1E), prélevez les tranches avec la pipette Pasteur en plastique élargie. Récupérez les tranches jusqu’à ce que le putamen caudé devienne visible à côté de l’hippocampe. En règle générale, entre 8 et 12 tranches de 300 μm (4 à 6 par hémisphère) peuvent être collectées pour le cerveau de la souris.
- À l’aide de la pipette Pasteur en plastique, prélevez les tranches et transférez-les dans la chambre de récupération dans le bain-marie (figure 1F) (récupérez les tranches après chaque série de tranchage pour éviter qu’elles ne flottent dans la chambre de tranchement).
note: Travaillez aussi vite que possible et assurez-vous que la solution de tranche à haute teneur en saccharose est glacée et carbogénée pendant toute la procédure. Si nécessaire, remplissez la glace entourant la chambre de tranche.
4. Récupération de tranches de cerveau pour des enregistrements électrophysiologiques
- Laissez les tranches dans la chambre de récupération remplie d’ACSF dans le bain-marie à 32 °C pendant 1 h
REMARQUE : Des chambres de récupération sont également disponibles dans le commerce.
- Sortez la chambre de récupération du bain-marie.
- Placez les tranches à RT pendant au moins 30 minutes supplémentaires pour la récupération avant de commencer toute autre application.
Recettes de tampon et de média.
Table 1 : 10 x pré-solution en tranches (1 L).
| composé | Concentration (mM) | Poids moléculaire (g/mol) | Montant (g) |
| Kcl | 25 | 74,55 | 1,86 |
| CaCl2 * 2H2O | 20 | 147.01 | 2,94 |
| MgSO4 * 7H2O | 10 | 246,48 | 2,46 |
| KH2PO4 | 12,5 | 136.08 | 1.7 |
Tableau 2 : 1x ACSF (1 L) (osmolarité entre 305 et 315 mOsm).
| composé | Concentration (mM) | Poids moléculaire (g/mol) | Montant (g) |
| NaCl | 125 | 58,44 | 7.3 |
| Kcl | 2.5 | 74,55 | 0,19 |
| CaCl2 * 2H2O | deux | à partir de 1 M de solution de CaCl2 | 2 mL |
| MgSO4 * 7H2O | 1 | à partir d’une solution de 1 M de MgSO4 | 1 mL |
| NaH2PO4 * 2H2O | 1,25 | 156.02 | 0,2 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 2,18 |
| Glucose * h2O | 25 | 198,17 | 4,95 |
Tableau 3 : 1x solution en tranches à haute teneur en saccharose (250 mL) (osmolarité entre 320 et 325 mOsm).
| composé | Concentration (mM) | Poids moléculaire (g/mol) | Montant (g) |
| Présolution de tranche 10x | n/a | n/a | 25 ml |
| saccharose | 252 | 342,3 | 21,57 |
| NaHCO3 | 26 | 84.01 | 0,55 |
| Glucose * h2O | 10 | 198,17 | 0,49 |
