Génération de tranches d’amygdale inclinées à partir d’un cerveau de souris

Dans cet article

Résumé

Source : Bosch, D., et al. Dissection optogénétique ex vivo des circuits de peur dans des tranches de cerveau. J. Vis. Exp. (2016)

La vidéo montre la génération de tranches d’amygdale inclinées à partir d’un cerveau de souris. Le cerveau est positionné à un angle sur la platine de l’échantillon de vibratome pour obtenir des coupes contenant l’amygdale et les axones du cortex préfrontal médian qui forment des connexions synaptiques avec l’amygdale. Les tranches de cerveau sont maintenues à la température physiologique afin de préserver le tissu pour d’autres expériences.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Préparation des tranches aiguës

Préparez du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF), une solution de coupe, des outils (ciseaux, scalpel, pince, spatule, pipette Pasteur) et des blocs de gélose
Remarque : 1 L de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) est nécessaire par expérience, et est préparé en dissolvant des produits chimiques dans du H₂O doublement distillé, comme publié précédemment. La solution de coupe est préparée en complétant 200 ml d’ACSF avec 0,87 ml de solution mère de 2 M MgSO₄.
Oxygéner l’ACSF et la solution de coupe tout au long de l’expérience avec 95 % d’O₂ et 5 % de CO_2.
Anesthésier profondément la souris à l’aide d’un appareil d’anesthésie pour petits animaux à l’aide d’isoflurane (3 % dans l’oxygène). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie à l’aide du réflexe de retrait du membre avant de continuer.
Décapitez la souris à l’aide de gros ciseaux et refroidissez immédiatement la tête dans une solution de coupe glacée.
Ouvrez le crâne par une seule incision médiane de la caudale au rostral et poussez doucement des morceaux de crâne sur les côtés à l’aide d’une pince. Retirez rapidement le cerveau en le retirant doucement du crâne à l’aide d’une petite spatule arrondie. Coupez le cervelet avec un scalpel. Placez le cerveau dans une solution de coupe glacée.
Pour les sites d’injection du cortex préfrontal médial ou du mPFC : coupez la partie antérieure du cerveau (contenant le mPFC) à l’aide d’un scalpel et mettez-la dans une solution de coupe glacée jusqu’à ce qu’elle soit tranchée.
Retirez l’excès de solution de coupe avec du papier filtre et collez la partie postérieure du cerveau sur la platine du vibratome.
Pour les tranches d’amygdale inclinées, collez le cerveau sur un bloc de gélose (4 %) coupé à un angle de 35° (Figure 1D, milieu). Pour les coupes d’amygdale coronale, les sites d’injection du noyau géniculé médial/du noyau thalamique intralaminaire postérieur (MGm/PIN) et des sites d’injection de mPFC, collez le cerveau directement sur la scène (Figure 1D, à gauche et à droite). Placez un bloc de gélose supplémentaire derrière le cerveau pour plus de stabilité pendant le tranchage.
Placez l’étage dans la chambre de coupe avec une solution de coupe oxygénée glacée maintenue à 4 °C à l’aide d’une unité de refroidissement. Préparez des coupes aiguës de l’amygdale (320 μm) à l’aide d’une lame de saphir. Placez les tranches dans une chambre d’interface alimentée en ACSF oxygéné à température ambiante (RT).
Après la préparation des tranches d’amygdale aiguë, placez la chambre d’interface dans un bain-marie à 36 °C pour récupérer les tranches pendant 35 à 45 min. Remettez ensuite la chambre d’interface sur RT.
Au début de l’étape 1.10, coupez des tranches des sites d’injection comme décrit précédemment pour les tranches aiguës de l’amygdale (étapes 1.8 - 1.9). La récupération des tranches dans le bain-marie n’est pas nécessaire ici. optionnel: Pour estimer rapidement l’emplacement du site d’injection, observez les coupes sur un stéréoscope équipé d’une lampe fluorescente et de jeux de filtres appropriés.

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Résultats

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Figure 1. Injections stéréotaxiques, préparation de coupes cérébrales aiguës et visualisation des fibres présynaptiques.(A, B) Injection stéréotaxique de virus. A) Photo d’une souris anesthésiée placée dans un cadre stéréotaxique avec le crâne exposé et la pipette d’injection. Encadré : Zoom avant sur l’image de la pipette d’injection remplie d’une solution virale mélangée à d...