Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut
1. Dissection de la DG (Durée : 15 min)
- Préparez les milieux d’isolement des noyaux 1 et 2 (NIM1 et NIM2), le tampon d’homogénéisation (HB) et le milieu de lavage (WM) (Tableau 1). Placez tous les tampons, les milieux, les réactifs et les outils sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Mettre l’homogénéisateur Dounce (voir Tableau des matériaux) sur de la glace pendant la préparation (minimum 1 h avant l’étape d’homogénéisation).
note: NIM1 peut être préparé et stocké à 4 °C jusqu’à 6 mois. NIM2, HB et WM doivent être fraîchement préparés.
prudence: Manipulez le dithiothréitol (DTT), l’inhibiteur de la protéase et le Triton X-100 avec précaution. Ces composés sont irritants pour la peau et les yeux, extrêmement toxiques et dangereux pour l’environnement aquatique. Lors de l’utilisation de ces produits chimiques, portez des gants de protection, des vêtements, une protection oculaire et faciale, lavez-vous soigneusement les mains après manipulation et évitez tout rejet dans l’environnement.
- Euthanasier une souris mâle C57Bl/6J de 22 mois par luxation cervicale en suivant la procédure de l’annexe 1 du bureau à domicile.
note: Voir la discussion pour la justification concernant l’utilisation de souris de 22 mois dans cette étude. Cependant, ce protocole peut être effectué à tout âge tout au long de la vie.
- Disséquez le cerveau d’une souris euthanasiée et transférez-le dans une boîte de Pétri de 10 cm remplie d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x glacée (Figure 1). Placez la boîte de Pétri sur de la glace. Retirez le cervelet à l’aide d’un scalpel et coupez le cerveau en deux entre les deux hémisphères (le long de l’axe sagittal).
- Remplissez une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm avec du PBS glacé et placez-la sur de la glace. Transférez la moitié du cerveau dans la nouvelle boîte de Pétri. À l’aide de jumelles, disséquez la DG et répétez cette étape pour obtenir la deuxième DG de la seconde moitié du cerveau.
note: Ces étapes (étapes 1.2 à 1.4) ont été adaptées d’une procédure décrite précédemment. Il est important de procéder le plus rapidement possible à cette étape afin de préserver l’intégrité des cellules.
- Transférez les deux DG dans l’homogénéisateur Dounce prérefroidi et ajoutez 1 mL de HB froid.
2. Dissociation tissulaire, isolement de noyaux uniques et immunomarquage anti-NeuN (Durée : 2 h)
- Homogénéisez le tissu avec 10 coups de pilon lâche « A », suivis de 15 coups de pilon « B » serré.
note: L’homogénéisation doit être effectuée avec le mortier sur de la glace avec des mouvements doux pour réduire la chaleur causée par le frottement et la mousse. Tous les tampons et l’équipement doivent être prérefroidis et conservés sur de la glace pendant la procédure.
- Transvaser l’homogénat dans un tube prérefroidi de 15 ml ; rincer l’homogénéisateur Dounce avec 1 mL de HB froid et mélanger dans le même tube. Ajouter 3 ml de HB dans le tube de 15 ml et incuber 5 min sur de la glace. Mélangez 2x en retournant doucement le tube.
- Prémouiller un capuchon de crépine de 70 μm avec 0,5 mL de HB sur un tube à essai de 50 mL. Filtrez la suspension de noyaux à partir de l’étape 2.2 en renversant doucement le tube de 15 mL dans la crépine de la cellule. Lavez la crépine de la cellule avec 0,5 mL de HB.
- Retirez la crépine de la cellule et centrifugez le tube à essai à 500 x g pendant 5 min à 4 °C, à l’aide d’une centrifugeuse à godet oscillant. Jetez le supernatant.
note: Le filtrage de l’homogénat aidera à réduire les débris, ce qui est essentiel pour la cytométrie en flux et les étapes en aval du séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq).
- Remettre la pastille en suspension doucement dans 4 mL de HB à l’aide d’une pipette P1000. Incuber sur glace pendant 5 min. Essorer à 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 3 mL de WM.
- Mouillez au préalable un capuchon de crépine de 35 μm sur un tube à essai de 15 mL avec 0,5 mL de WM. Filtrez la suspension de noyaux de l’étape 2.5 à travers la crépine de la cellule, en pipetant doucement 0,5 mL à la fois à l’aide d’une pipette P1000.
- Lavez le capuchon de la passoire avec 0,5 ml de WM et placez le tube sur de la glace. Transvaser le filtrat dans un tube neuf de 15 mL et centrifuger pendant 5 min et 4 °C à 500 x g. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 3 mL de WM.
- Essorer à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de MW avec l’antigène nucléaire antineuronal (NeuN) de souris, l’anticorps conjugué à AlexaFluor 488 (anti-NeuN-AF488, 1:32 000) et 1 μg/mL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Incuber 45 min sur glace dans l’obscurité.
note: Pour optimiser l’immunocoloration des noyaux isolés, il est recommandé de titrer l’anticorps afin de déterminer la dilution optimale pour l’analyse et le tri par cytométrie en flux. Ensuite, exécutez des contrôles adéquats pour confirmer que les conditions de coloration sont optimales. Par exemple, avec l’anticorps conjugué anti-NeuN-AF488, un témoin négatif (c’est-à-dire aucun ajout de l’anticorps, figure 2A) et un contrôle positif (c’est-à-dire coloration avec l’anticorps, figure 2B) ont été exécutés pour évaluer la ségrégation des populations non colorées et colorées. Lorsque vous commencez à travailler avec un anticorps conjugué à l’AF488, il est recommandé d’effectuer un contrôle d’isotype conjugué à l’AF488 pour évaluer la spécificité. Si un anticorps non conjugué est utilisé, un contrôle supplémentaire, tel que l’ajout d’un anticorps secondaire uniquement à une préparation de noyaux, peut être nécessaire pour évaluer la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire.
3. Tri des noyaux activés par fluorescence (FANS) pour exclure les populations neuronales (Durée : 45 min)
- Transférez la suspension de noyaux immuno-colorés dans un tube à essai de 5 mL et conservez-la sur de la glace jusqu’au début de la procédure de cytométrie en flux.
note: Si vous travaillez avec des morceaux de tissu plus gros que deux DG de souris, une dilution supplémentaire avec un tampon WM peut être nécessaire pour éviter de boucher le trieur de cellules activées par fluorescence (FACS) si la densité des noyaux dans la solution devient élevée.
- Vortex les échantillons pendant 3 s à basse vitesse avant de placer les tubes dans l’instrument FACS (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : (configuration FACS) Les machines de tri doivent être alignées au début de la procédure avec les particules d'étalonnage conformément aux recommandations du fabricant. Le délai de chute a été calibré avec des billes ou des microsphères (voir Tableau des matériaux) selon le modèle FACS. Les échantillons ont été triés à 4 °C en mode pureté. Pour réduire le volume de collecte, les noyaux ont été triés à travers une buse de 70 μm à la pression recommandée pour le cytomètre en flux. Les noyaux ont été triés dans des tubes à faible liaison de 1,5 mL (voir le tableau des matériaux) contenant 50 μL de WM. Tous les tubes de prélèvement ont été enrobés de PBS + 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) à 4 °C pendant la nuit afin de réduire le risque de collage des noyaux aux parois du tube.
- Pour obtenir les données à partir d’un échantillon de la suspension de noyaux colorés, réglez les portes en hauteur DAPI et en zone DAPI afin d’exclure les débris cellulaires et les noyaux agrégés (Figure 3A). De plus, séparez les noyaux uniques de tous les agrégats ou débris cellulaires restants colorés au DAPI en plaçant les portes dans la zone de diffusion latérale logarithmique (SSC) et la zone de diffusion directe logarithmique (FSC) (Figure 3B).
- Réglez les portes pour l’anti-NeuN-AF488 et la zone FSC, afin d’isoler la population négative à NeuN-AF488, comme le montre la figure 3C.
- Après l’analyse, à l’aide de la stratégie de contrôle décrite ci-dessus, trier la population négative à NeuN-AF488 dans un tube de prélèvement de 1,5 mL rempli de 50 μL de WM.
note: Suite à la stratégie de déclenchement décrite ci-dessus et à la procédure de dissection visant à isoler le DG du cerveau d’une souris adulte, la population négative NeuN-AF488 devrait représenter ~14 % des noyaux uniques.
Tableau 1 : Compositions des milieux et des tampons utilisés dans l’étude.
| Milieu d’isolement des noyaux #1 (NIM1) - stocker jusqu’à 6 mois à 4 °C |
| composant | Volume (μL) | Concentration finale (mM) |
| 1,5 M de saccharose | 1 833,30 | 250 |
| 1 M KCl | 275 | 25 |
| 1 M MgCl2 | 55 | 5 |
| 1 M tampon Tris, pH 8,0 | 110 | 10 |
| Eau sans nucléases | 8 726,70 | - |
| Volume total | 11 000 | - |
| Milieu d’isolement des noyaux #2 (NIM2) – Make Fresh |
| composant | Volume (μL) | Concentration finale |
| NIM1 | 10 769 | - |
| 1 mM de TNT | 11 | 1 μM |
| 100x inhibiteur de protéase | 110 | 1x |
| Triton X-100 10 % (v/v) | 110 | 0,1 % (v/v) |
| Volume total | 11 000 | - |
| Tampon d’homogénéisation (HB) – faire du neuf |
| composant | Volume (μL) | Concentration finale |
| NIM2 | 10 958,75 | - |
| Inhibiteur de la RNase, 40 U μL-1 | 27,5 | 100 U mL-1 |
| RNasin, 40 U μL-1 | 13,75 | 50 U mL-1 |
| Volume total | 11 000 | - |
| Média de lavage (WM) |
| composant | Volume (μL) | Concentration finale |
| BSA 7,5 % | 1 466,70 | 1 % |
| Inhibiteur de la RNase, 40 U μL-1 | 27,5 | 100 U mL-1 |
| RNasin, 40 U μL-1 | 13,75 | 50 U mL-1 |
| Pbs | 9 492,05 | - |
| Volume total | 11 000 | - |
