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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Matériaux
- Préparez les solutions suivantes avant de commencer le protocole :
- Préparez le tampon de charge en ajoutant du sérum de veau fœtal (FBS, 2 %) à une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajoutez un colorant rouge neutre (NR) (1 % final) au PBS.
- Préparez les solutions suivantes à l’aide de la trousse de dissociation du cerveau adulte disponible dans le commerce (voir le tableau des matières).
- Pour préparer le mélange d’enzymes 1, pipetez 1,9 mL de tampon Z et 50 μL d’enzyme P dans un tube à centrifuger de 15 mL.
- Pour préparer le mélange d’enzymes 2, pipeter 20 μL de tampon Y et 10 μL d’enzyme A dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Préparez la solution d’enlèvement des débris.
2. Perfusion et dissection de souris
- Injecter à la souris par voie intrapéritonéale (i.p.) 500 μL de colorant NR à 1 % dans du PBS 2 à 3 h avant l’anesthésie.
note: L’injection intrapéritonéale de NR dans des modèles murins démyélinisants permet de discerner les lésions (Figure 1).
- Anesthésier la souris avec du pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) et s’assurer que la souris est anesthésiée avec succès en examinant les réponses à la douleur.
- Ouvrez la cavité thoracique de la souris et exposez le cœur.
- Coupez soigneusement un petit coin de l’oreillette droite et perfuser la souris par voie intracardiale avec 20 à 30 ml de PBS froid du ventricule gauche.
- Décapitez la souris sous anesthésie.
- Ouvrez le crâne de la souris et libérez soigneusement le cerveau du crâne.
- Transférez le cerveau dans le moule à tranches de cerveau de souris et coupez le cerveau en tranches de 0,1 cm.
- Retirez les tranches de cerveau et placez-les dans du PBS froid dans une boîte de Pétri (60/15 mm). À l’aide d’une pince microchirurgicale, microdissèquez les lésions marquées par un colorant NR autour du corps calleux au microscope.
note: S’assurer que le tissu disséqué est aussi complet que possible pour faciliter le transfert ultérieur ; La progression totale de la dissection doit être terminée en 2 heures.
- Transférez le tissu disséqué dans des tubes à centrifuger de 15 ml contenant la quantité appropriée de tampon de charge à froid.
note: Regroupez le tissu du corps calleux de 2 à 3 souris dans un seul tube comme un seul échantillon.
3. Dissociation tissulaire
- Centrifuger le tissu disséqué à 300 ×g pendant 30 s (après avoir atteint cette vitesse) pour prélever l’échantillon au fond du tube.
- Préchauffer le mélange d’enzymes 1 et 2 à 37 °C dans un incubateur.
- Ajouter 1 950 μL de mélange d’enzymes préchauffé 1 à un échantillon et digérer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 min.
- Ajouter 30 μL de mélange d’enzymes préchauffé 2 et mélanger délicatement.
- Digérer dans un incubateur à 37 °C pendant 15 min et mélanger doucement toutes les 5 min.
- Ajouter 4 ml de PBS froid dans le tube après la digestion et agiter doucement.
- Placez les filtres de 70 μm sur des tubes de centrifugation de 50 mL et prémouillez les filtres avec 500 μL de PBS froid. Filtrez le tissu dissocié en faisant passer les échantillons de tissus digérés à travers les filtres, puis transférez la suspension filtrée dans le tube à centrifuger de 50 ml dans un tube à centrifuger de 15 ml.
note: Sautez cette étape si la quantité de tissu est trop faible.
- Centrifuger les échantillons de tissus filtrés à 300 ×g pendant 10 min à 4 °C et aspirer le surnageant lentement et complètement.
note: Toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glace à l’exception de la digestion enzymatique.
4. Enlèvement des débris
- Remettez doucement la pastille cellulaire en suspension avec 1 550 μL de PBS froid.
- Ajouter 450 μL de solution froide pour enlever les débris et bien mélanger.
- Superposez lentement et doucement le mélange ci-dessus avec 2 x 1 mL de PBS froid à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
note: Inclinez le tube de centrifugation de 45 ° et ajoutez lentement du PBS le long de la paroi du tube avec la pipette.
- Transférez lentement et doucement le tube dans une centrifugeuse et faites-le tourner à 4 °C et 3 000 × g pendant 10 min.
- Recherchez trois couches après la centrifugation. Aspirez complètement les deux couches supérieures à l’aide d’une pipette de 1 000 μL (Figure 2).
- Remplissez le tube jusqu’à 5 ml avec un tampon de chargement à froid et retournez doucement le tube trois fois.
- Centrifuger à 4 °C et 1 000 × g pendant 10 min. Aspirer complètement le surnageant et éviter de perturber la pastille cellulaire.
5. Séparation magnétique des cellules microgliales
- Remettez la pastille en suspension avec 90 μL de tampon de charge et ajoutez 10 μL de billes de CD11b (microglie).
- Bien mélanger et incuber 15 min à 4 °C.
- Ajoutez 1 ml de tampon de chargement et pipetez doucement le liquide de haut en bas avec une pipette de 1 000 μL pour laver les cellules après l’incubation. Centrifuger les cellules à 4 °C et 300 × g pendant 10 min et aspirer complètement le surnageant pour éliminer les billes non liées.
- Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de tampon de chargement.
- Placez la colonne MS avec son séparateur pour une sélection positive dans le champ magnétique.
- Rincer la colonne avec 500 μL de tampon de chargement pour protéger les cellules et assurer l'efficacité du tri magnétique, en suivant le protocole du fabricant.
- Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne MS et jetez le flux contenant les cellules non étiquetées.
- Ajoutez trois fois 500 μL de tampon de chargement dans la colonne pour éliminer les cellules qui adhèrent à la paroi de la colonne et jetez le flux.
note: N’ajoutez un nouveau tampon de chargement pour le lavage que lorsque le réservoir de la colonne est vide.
- Retirez la colonne du séparateur après l’avoir lavée et placez-la sur un tube à centrifuger de 15 ml.
- Ajoutez 1 ml de tampon de chargement dans la colonne et poussez le piston vers le bas pour évacuer les cellules marquées magnétiquement. Répétez cette étape trois fois pour collecter complètement les cellules marquées magnétiquement.
