Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la solution
- Plaques NGM-Agar (1 L)
- Ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone (par ex. Bacto-Peptone) et 20 g de gélose. Après l’autoclavage, ajoutez 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans du stock d’éthanol à 95 % [EtOH]), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4 et 1 mL d’amphotéricine B (2,5 mg/mL de stock).
- Plaques d’ARNi NGM-Agar (1 L)
- Ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de milieu peptone et 20 g d’agar. Après l’autoclavage, ajouter 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans un stock d’EtOH à 95 %), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4, 1 mL d’amphotéricine B (2,5 mg/mL), 1 mL de 1 M d’isopropyl-β-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et 1 mL de carbénicilline (50 mg/mL).
- Luria-Bertani (LB)-Gélose (1 L)
- Ajouter 10 g de peptone média, 5 g d’extrait de levure, 5 g de NaCl, 20 g d’agar, 10 mL de 1 M Tris pH 8,0. Ajouter H2O à 1 L. Après l’autoclavage, ajouter 1 mL de carbénicilline à 50 mg/mL et 2,5 mL de tétracycline à 5 mg/mL.
- LB Moyen (1 L)
- Ajouter 10 g de milieu peptone, 5 g d’extrait de levure, 5 g de NaCl et 10 ml de 1 M de Tris pH 8,0. Ajouter H2O à 1 L. Après l’autoclavage, ajouter 1 mL de carbénicilline à 50 mg/mL.
- Tampon M9 (1 L)
- Ajouter 6,0 g de Na2HPO4, 3 g de K2PO4, 5 g de NaCl et 50 mg de gélatine. Avant l’utilisation, ajouter 1 mL de 1 M MgSO4.
- Solution de blanchiment (10 mL)
- Ajouter 1 mL de NaClO et 2 mL de 5 N NaOH. Ajouter H2O à 10 mL.
2. Préparation des plaques ARNi
Remarque : C. elegans est généralement cultivé en laboratoire sur des plaques de Pétri de 6 cm contenant 7,5 mL de gélose gélose au milieu de croissance des nématodes (NGM-Agar). Ce protocole est optimisé pour les vers maintenus à 15 °C. Pour préparer des plaques avec NGM, utilisez des techniques stériles standard pour éviter la contamination fongique et bactérienne. Ce qui suit est le protocole de préparation des plaques NGM complétées par des réactifs pour l’ARNi.
- Préparez des plaques d’ARNi NGM-Agar de 6 cm contenant 1 mM d’IPTG et 50 μg/mL de carbénicline. Laissez-les sécher pendant 24 à 48 h à température ambiante dans l’obscurité.
- Conservez les plaques d’ARNi à 4 °C dans l’obscurité. Ne pas utiliser si vous avez plus de 14 jours.
- Sélectionner le clone de la bactérie ARNi (Escherichia coli HT115) contenant le plasmide L4440 avec la séquence d’ADN du gène lin-53 à partir de la souche de glycérol congelée de la banque d’ARNi disponible13 sur des plaques de gélose LB contenant 50 μg/mL de carbénicilline et 12,5 μg/mL de tétracycline en utilisant le schéma de stries triphasées. Cultivez les bactéries à 37 °C pendant la nuit. Ce clone permet la production dépendante de l’IPTG de l’ARNdb lin-53 dans la bactérie.
- De plus, cultivez des bactéries ARNi qui contiennent le plasmide L4440 sans aucune séquence génétique comme vecteur de contrôle vide.
- Le lendemain, prélever une seule colonie dans des plaques de gélose LB à vecteur lin-53 ou vides à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL et inoculer chacune d’entre elles dans un tube de culture séparé contenant 2 mL de milieu LB liquide complété par 50 μg/mL de carbénicline. Cultivez les cultures pendant la nuit à 37 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité optique (DO) à 600 nm de 0,6 à 0,8. Mesurez la DO à l’aide d’un spectrophotomètre.
ATTENTION : Le milieu liquide LB ne doit pas contenir de tétracycline contrairement à la plaque de gélose LB utilisée pour strier les bactéries du stock de glycérol, car l’inclusion de tétracycline pendant l’alimentation entraîne une diminution de l’efficacité de l’ARNi.
- Ajouter 500 μL de chaque culture bactérienne (lin-53 ou vecteur vide) sur des plaques d’ARNi NGM-Agar de 6 cm à l’aide d’une multipipette. Incuber les assiettes avec un couvercle fermé pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité pour les faire sécher. Pendant ce temps, l’IPTG dans les plaques NGM induira la production d’ARNdb chez les bactéries.
- Utiliser au moins 3 plaques par culture bactérienne et par expérience. Cela fournira 3 répliques techniques pour chaque expérience.
- Conservez les plaques d’ARNi séchées contenant des bactéries à 4 °C dans l’obscurité pendant une période pouvant aller jusqu’à deux semaines.
3. Préparation de la souche BAT28 de C. elegans
- Maintenir la souche de ver BAT288 contenant les transgènes otIs305 [hsp-16.2prom ::che-1, rol-6(su1006)] et ntIs1 [gcy-5prom ::gfp] sur les bactéries OP50 à l’aide de plaques NGM-Agar standard à 15 °C.
Remarque : Pour un protocole détaillé sur la culture des nématodes, voir. Le rol-6 (su1006) est un allèle dominant et un marqueur d’injection phénotypique couramment utilisé16 qui provoque le mouvement de roulement typique. Il est utilisé dans le transgène otIs305 pour suivre hsp-16.2prom ::che-1.
- Maintenir la souche BAT28 à 15 °C en tout temps afin d’éviter l’activation préventive du transgène hsp-16.2prom ::che-1. Réduisez l’exposition à des températures supérieures à 15 °C tout en manipulant la souche autant que possible.
- Pour synchroniser l’âge des vers, utilisez la technique du blanchiment.
- Laver les plaques de gélose NGM-Agar de 6 cm contenant des adultes et des œufs de BAT28 à l’aide d’un tampon M9 de 900 μL. Vers granulés par centrifugation à 900 x g pendant 1 min. Retirez le surnageant.
- Ajouter 0,5 à 1 mL de solution de blanchiment et agiter le tube pendant environ 1 minute jusqu’à ce que les vers adultes commencent à éclater. Moniteur à l’aide d’un stéréomicroscope standard.
- Granuler les vers par centrifugation à 900 x g pendant 1 min. Retirer le surnageant.
- Lavez la pastille de ver 3 fois en ajoutant 800 μL de tampon M9 et en la centrifugant à 900 x g.
- Placez les œufs nettoyés sur des plaques NGM fraîches ensemencées avec la bactérie OP50. Cultiver une population blanchie sur des bactéries OP50 à 15 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade L4 (environ 4 jours). Les larves L4 peuvent être reconnues par une tache blanche à peu près à mi-chemin le long de la face ventrale du ver18 à l’aide d’un stéréomicroscope standard.
note: Pour obtenir le phénotype de conversion de la cellule germinale en neurone lors de l’épuisement de lin-53, il doit être épuisé dans la génération parentale (P0). La notation du phénotype de conversion est effectuée dans la génération suivante (génération filiale F1). Pour atteindre l’épuisement de la lin-53 déjà présent dans la P0, les animaux L4 sont soumis à l’ARNi.
- Transférez manuellement 50 vers de stade L4 par répétition à l’aide d’un fil de platine sur une plaque NGM qui ne contient aucune bactérie et laissez les vers s’éloigner de toute bactérie OP50 transférée. Laissez les vers se déplacer sur la plaque pendant environ 5 minutes. Utilisez des bactéries des plaques d’ARNi NGM-Agar préalablement ensemencées avec des bactéries ARNi lin-53 (ou un contrôle vectoriel vide) à transférer vers les plaques ARNi respectives.
- Évitez de transférer la bactérie OP50 sur les plaques ARNi réelles. Travaillez rapidement pour minimiser le temps d’exposition de la souche à des températures supérieures à 15 °C.
- Incuber les vers sur des plaques d’ARNi NGM-Agar à 15 °C pendant environ 7 jours jusqu’à ce que la descendance F1 des vers atteigne les stades L3 et L4. Ils peuvent être clairement séparés des animaux P0 car ils sont plus grands et plus épais que la progéniture F1.
- Vérifiez visuellement, à l’aide d’un stéréomicroscope standard, si les vers de la descendance F1 présentent le phénotype de la vulve saillante (pvul), comme le montre la figure 1. L’ARNi contre lin-53 a des effets pléiotropiques et provoque le phénotype pvul qui peut être utilisé pour évaluer si l’ARNi contre lin-53 a été efficace.
note: L’ARNi contre lin-53 peut également provoquer la létalité des embryons F1. Cet effet augmente si les plaques sont exposées à des degrés supérieurs à 15 °C avant que les animaux n’atteignent les stades L3 et L4. Les embryons morts peuvent être reconnus par un développement arrêté et l’absence d’éclosion.
- Incuber les plaques dans l’obscurité car l’IPTG est sensible à la lumière.
4. Induction de la reprogrammation des cellules germinales
- Incubé a examiné des plaques d’ARNi contenant de la descendance F1 traitée par lin-53 et un ARNi vecteur vide pendant 30 minutes à 37 °C dans l’obscurité pour activer CHE-1. Utilisez un incubateur ventilé car il permet un choc thermique plus efficace.
- Laissez les animaux choqués par la chaleur récupérer pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité, puis incubez des plaques à 25 °C pendant la nuit dans l’obscurité.
- À l’aide d’un stéréomicroscope standard couplé à une source lumineuse à fluorescence, examinez les animaux sous le filtre à protéine fluorescente verte (GFP) pour les signaux dérivés de gcy-5prom ::gfp dans la zone médiane du corps des vers, comme le montre la figure 2. Réglage du microscope pour les signaux GFP : excitation maximale à 488 nm avec émission maximale à 509 nm.
- Évaluer le degré de conversion des cellules germinales en neurones en montant des animaux avec des signaux GFP dans la zone médiane du corps sur des lames de microscopie contenant des tampons gélosés.
- Comptez le nombre d’animaux montrant la conversion des cellules germinales en neurones par rapport aux animaux foncés pour évaluer la pénétrance phénotypique. En règle générale, environ 30 % des animaux présentent des signaux GFP discrets dans la lignée germinale lors de la déplétion en lin-53, tandis que pas plus de 5 % des animaux présentent des signaux GFP diffus dans la lignée germinale sur l’ARNi vecteur vide.
