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Avertissement : Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Homogénéisation mécanique du cerveau et de la moelle épinière
REMARQUE : Les volumes décrits dans cette section sont suffisants pour l’homogénéisation d’une moitié du cerveau ou de la moelle épinière.
- Pré-refroidissez le mortier de verre du broyeur de tissus Dounce (Table des matériaux) posé sur de la glace.
- Ajouter 3 ml de solution saline équilibrée 1x Hank's (HBSS) pré-refroidie au mortier.
- Transférez le tissu (cerveau ou moelle épinière) du puits de la plaque à 6 puits dans le mortier de verre, en vous assurant qu’il est trempé dans 1x HBSS et qu’il se trouve au fond du mortier.
- Écrasez doucement le tissu avec 10 coups de pilon A suivis de 10 coups de pilon B. Transférez le mélange homogénéisé dans un nouveau tube conique de 15 ml.
- Remplissez le tube jusqu’à un volume final de 10 mL à l’aide d’un HBSS 1x pré-refroidi et centrifugez pendant 10 min à 320 x g à 4 °C.
- Aspirez le surnageant et ajoutez de la glace 1x HBSS dans chaque tube jusqu’à un volume final de 7 mL et remettez doucement la pastille en suspension par vortex.
2. Enlèvement des débris
REMARQUE : L’élimination des débris, composés principalement de tissus non digérés et de gaines de myéline, est une étape critique pour permettre une coloration efficace de l’homogénat tissulaire pour les analyses cytométriques en flux ultérieures.
- Filtrez chaque échantillon à travers une passoire de 70 μm pour éliminer tous les morceaux de tissu non digérés. Cette étape est particulièrement importante lorsque l’on travaille avec des tissus de la moelle épinière, car ces échantillons sont plus susceptibles de contenir des fragments de nerfs non digérés ou des méninges qui pourraient affecter les étapes suivantes.
- Assurez-vous que le volume final est de 7 ml dans chaque tube d’échantillon. Sinon, remplissez de 1x HBSS glacé jusqu’à 7 ml.
- Ajouter 3 mL de solution isotonique de Percoll (IPS) pré-refroidie à chaque échantillon pour obtenir un volume final de 10 mL d’une solution contenant un milieu à gradient de densité à une concentration finale de 30 %. Tourbillonnez doucement les échantillons pour vous assurer qu’ils sont mélangés de manière homogène.
- La centrifugeuse échantillonne pendant 15 min à 700 x g à 18 °C, en veillant à régler l’accélération de la centrifugeuse à 7 et le frein à 0,
note: La centrifugation devrait prendre environ 30 min.
- Retirez délicatement les échantillons de la centrifugeuse.
note: Un disque blanchâtre composé de débris et de myéline doit être visible flottant à la surface de la solution. Une pastille (contenant les cellules d’intérêt) doit être visible au fond du tube.
- Aspirez soigneusement tout le disque blanchâtre de débris puis le reste du surnageant, en veillant à ne pas déloger la pastille. Laissez environ 100 μL de solution sur la pastille de cellule pour éviter le risque de la déloger par inadvertance.
- Ajoutez 1 mL de solution bloquante (BL) de cytométrie en flux (FACS), remettez la pastille en suspension en le pipetant de haut en bas avec une pointe de pipette de 1000 μL et transférez les échantillons dans des tubes de 1,5 mL.
- Centrifugeuse pendant 5 min à 450 x g à température ambiante (RT).
- Aspirer doucement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans le tampon approprié compatible avec les analyses en aval