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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des matériaux
- Tampon de tri cellulaire activé par magnétisme (MACS) : Préparez 2 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) et 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) (Table des matériaux) dans du PBS-/-.
- Solution mère de collagénase IV (20 U/μL) : Remettre la poudre en suspension dans du PBS+/+ (Table des matériaux), aliquote, et conserver à -20 °C.
note: La collagénase IV nécessite que le MgCl2 soit pleinement actif ; ne pas geler et décongeler la solution de collagénase IV.
- Solution anesthésique-analgésique : Mélanger 150 μL de kétamine (150 mg/kg), 25 μl de xylazine (5 mg/kg) et 330 μl de buprecare (0,1 mg/kg) dans 1 mL de PBS-/-.
note: Préparez la solution anesthésique-analgésique de manière improvisée et ne la conservez pas plus d’une journée.
- Solution d’héparine (100 U/mL) : Remettre la poudre en suspension dans du PBS-/-.
- Préparez le système d’insertion de perfusion reliant un tube à un Erlenmeyer de carafe rempli de PBS-/-. Connectez une aiguille de 23 G à l’extrémité du tube de perfusion. Ouvrez l’insert de perfusion et laissez fonctionner le PBS jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles dans le tube.
- Préparez la loupe binoculaire équipée d’une lumière.
2. Logement des souris C57BL/6
- Pour l’analyse des cellules myéloïdes ou T de CP (plexus choroïdes), utilisez quatre souris pour chacune et regroupez les quatre CP (deux de chaque ventricule latéral, le troisième ventricule et le quatrième ventricule CP ; pour huit souris au total). Ne pas regrouper les PC comporte le risque de ne pas détecter les rares populations immunitaires dans les PC en raison de leur faible abondance.
- Laissez les souris s’acclimater pendant au moins 7 jours avant toute expérimentation. Conservez les souris dans des conditions exemptes d’agents pathogènes, à température et humidité constantes, dans un cycle lumière/obscurité de 12/12 h ou 14/10 h, avec de l’eau et de la nourriture en granulés standard à volonté.
3. Perfusion PBS et dissection cérébrale
- Peser chaque souris et injecter 10 μL/g de la solution de mélange anesthésique-analgésique (étape 1.3) par voie intrapéritonéale.
- Attendez environ 30 min pour une analgésie efficace (vérifiez la profondeur de l'anesthésie en pinçant les doigts de la souris).
- Positionnez la souris anesthésiée à plat sur le dos sur le support de dissection et collez ses paumes sur le support de dissection.
- En pinçant la peau de l’animal à l’aide d’une pince et à l’aide de ciseaux, ouvrez l’abdomen, le diaphragme et le thorax pour exposer le cœur.
note: Lorsque le thorax est ouvert, le cerveau devient anoxique. Il faut procéder avec précision et rapidité à travers les étapes suivantes de la perfusion.
- Injecter 20 μL de solution d’héparine à 100 U/mL directement dans le ventricule gauche.
- Avec des ciseaux fins, faites une incision d’au moins 3 mm dans l’oreillette droite pour permettre au sang de s’écouler hors du corps.
- Immédiatement après, insérez l’aiguille de 23 G placée à l’extrémité du tube de perfusion à travers l’extrémité du ventricule gauche.
- Ouvrez le système de perfusion au maximum et attendez la perfusion complète : à l’aide d’une aiguille de 23 G à un débit d’environ 6 mL/min, la perfusion est complète en 3 min.
note: La décoloration uniforme d’organes tels que le foie atteste de l’efficacité de la perfusion.
- Fermez le système de perfusion et retirez l’aiguille du ventricule cardiaque.
- Retirez le ruban adhésif des paumes de la souris. Placez la souris en position ventrale.
- En pinçant la peau de l'animal avec des pinces et à l'aide de ciseaux, retirez la peau du haut de la tête, des yeux aux oreilles.
- À l’aide de ciseaux, coupez le crâne d’abord entre les yeux, puis latéralement de chaque œil à la moelle épinière juste au-dessus des muscles masséters. Pour cela, utilisez l’extrémité des ciseaux et procédez doucement pour éviter d’endommager le cerveau avec les ciseaux.
- Ouvrez le crâne avec une pince en le pinçant à l’extrémité entre les yeux.
- Utilisez des ciseaux pour couper la moelle épinière et extraire le cerveau avec des pinces, en plaçant leurs deux points sur le côté latéral du cerveau pour l’incliner et le placer dans une boîte de Pétri remplie de PBS+/+ glacé. Les PC sont alors immédiatement collectés.
note: Vérifiez la décoloration du cerveau pour vérifier l’efficacité de la perfusion.
4. Dissection du plexus choroïde du cerveau
- Positionnez le côté dorsal du cerveau vers le haut dans la boîte de Pétri et sous les objectifs des loupes binoculaires.
- À l’aide d’une pince pour maintenir le cerveau en place, insérez les deux extrémités d’une autre pince à travers la ligne médiane entre les hémisphères.
- Utilisez la pince pour éloigner le cortex avec le calleux et l’hippocampe du septum, exposant ainsi le ventricule latéral et une partie du troisième ventricule.
- Identifiez la PC latérale comme un long voile tapissant le ventricule latéral qui s’évase aux deux extrémités. Utilisez les deux extrémités d’une pince fine pour attraper le CP latéral. Veillez à collecter la partie postérieure triangulaire qui peut être cachée par le pli postérieur de l’hippocampe.
- Tirez le cortex, le corps calleux et l’hippocampe de l’hémisphère controlatéral loin du septum pour exposer tout le troisième ventricule et le ventricule latéral opposé.
- Recueillir le troisième PC à l’aide d’une pince fine, qui peut être identifiée comme une structure courte avec un aspect de surface granulaire.
- Récupérez l’autre PC latéral.
- Insérez les deux extrémités d’une pince entre le cervelet et le mésencéphale. Détachez le cervelet du pont et de la moelle pour exposer le quatrième ventricule.
- Identifiez la quatrième PC comme une longue structure globulaire avec un aspect de surface granuleuse qui tapisse le quatrième ventricule de l’extrémité latérale droite à l’extrémité gauche entre le cervelet et la moelle. Récupérez le quatrième PC à l’aide d’une pince fine.
note: Le revêtement à base de silane des pinces peut empêcher l’adhérence de la PC sur les pinces.
- Répétez les étapes 3.1 à 4.9 pour chacune des sept autres souris. Entre-temps, la PC recueillie peut être conservée temporellement dans un tube placé sur de la glace.
5. Préparation des échantillons pour l’analyse par cytométrie en flux
- Remplissez le tube contenant tous les PC disséqués à 750 μL de PBS+/+.
note: Le dépôt de CP disséqué à l’aide d’une pince fine dans le tube produit un petit volume de PBS+/+. Pour éviter une éventuelle perte de tissu CP, il est préférable de compléter le volume existant à 750 μL plutôt que de le retirer et de le remplacer par 750 μL frais de PBS+/+.
- Ajouter 15 μL de solution mère de collagénase IV à 20 U/μL (voir étape 1.2) pour une concentration finale de 400 U/mL.
note: L’ADN I (150 μg/mL) peut prévenir l’agglutination excessive des cellules.
- Incuber la CP avec la collagénase IV à 37 °C sous une légère agitation (300 tr/min) pendant 45 min.
- Pipetez doucement de haut en bas environ 10 fois pour finaliser la dissociation de la CP.
- Remplissez le tube CP à 1,5 mL avec un tampon MACS (voir l’étape 1.1 de la recette) pour arrêter l’activité de la collagénase IV.
note: L’activité de la collagénase IV est arrêtée à basse température et inhibée par l’albumine sérique.
- Centrifuger les cellules à 500 x g, pendant 5 min, à 4 °C. Jeter le surnageant et laver les cellules avec 1,5 mL de tampon MACS.
- Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min, à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 220 μL de tampon MACS.