Obtention d’une culture mixte de cellules gliales à partir d’un cerveau de souris néonatale

Résumé

Source : Sarkar, S. et al., Isolation magnétique CD11b rapide et raffinée de la microglie primaire avec une pureté et une polyvalence accrues. J. Vis. Exp. (2017)

La vidéo a démontré la méthode d’isolement et de culture de cellules à partir du cerveau d’une souris néonatale. Il impliquait une dissociation enzymatique et mécanique du cerveau, suivie d’une culture dans un milieu de croissance dépourvu de facteur de croissance neuronale pour obtenir une population gliale mixte.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Culture de cultures gliales mixtes

1. Décapitez rapidement les chiots de 1 à 2 jours avec des ciseaux de 5,5 pouces et placez immédiatement les têtes dans un tube de 50 ml sur de la glace. Notons que cette décapitation est le mode d’euthanasie.
2. Dans une cagoule à flux d’air laminaire, faites une petite incision dans le crâne et les méninges à l’aide de ciseaux de micro-dissection droits de 4,5 pouces. Commencez à couper de l’extrémité caudale à l’extrémité rostrale (nez). Passez sous la peau en utilisant l’ouverture formée par la décapitation.
   1. Après l’incision, pelez l’un des hémisphères sur le côté. Ensuite, utilisez une pince à épiler incurvée ou crochue pour retirer tout le cerveau.
3. Immergez le cerveau dans un nouveau tube de 50 mL contenant 0,25 % de trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 15 min dans un bain d’eau à 37 °C. Utilisez 2 ml de trypsine-EDTA par cerveau.
4. Lavez le(s) cerveau(x) avec un milieu de croissance frais (10 % de sérum de veau fœtal (FBS), mélange de milieu et de nutriments F12 Modified Eagle de Dulbecco (DMEM/F12), 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de L-glutamine, 1 % de pyruvate de sodium et 1 % d’acides aminés non essentiels) en ajoutant et en retirant le milieu. Répétez cette opération 4 fois.
5. Pour chaque cerveau, plaquez deux flacons T-75 contenant des milieux de croissance. Par conséquent, ajoutez 2 ml de milieu de croissance par cerveau dans le tube. Ainsi, ce sera l’équivalent de 1 mL de cerveau homogénéisé avec 8-9 mL de milieu de croissance par fiole T-75.
6. Homogénéiser en triturant le(s) cerveau(x) à l’aide de pipettes de différentes tailles d’ouverture, dans l’ordre de la plus grande à la plus petite. Lorsqu’il est visible que le tissu cérébral ne rétrécit pas, passez à la pipette suivante. À la fin de la trituration, la suspension doit être claire, sans morceaux visibles.
   1. Utilisez une pipette de 25 ml, une pipette de 5 ml, puis une pipette de 10 ml de manière séquentielle.
7. Passez chaque suspension cérébrale homogène dans une crépine cellulaire de 70 μm pour en faire une culture unicellulaire.
8. Pour chaque cerveau homogénéisé, mettre en plaques deux fioles T-75 contenant des milieux de croissance, comme décrit à l’étape 1.5 (1 mL de cerveau homogénéisé avec 8 à 9 mL de milieux de croissance par fiole T-75).
9. Changer de milieu de croissance après 6 jours et cultiver jusqu’à l’isolement le 16^e jour.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Technologies de la vie	11330057
Pyruvate de sodium	Technologies de la vie	11360070
MEM Acides aminés non essentiels (100x)	Technologies de la vie	11140050
L-Glutamine (100x)	Technologies de la vie	25030081
Edta	Fisher Scientific	AM9260G
Sérum fœtal bovin	sigma	13H469
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco par Life Technologies	Référence 25200