Différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules de type microglie

Résumé

Source : Funes, S. et al., Cellules microgliales humaines : différenciation à partir de cellules souches pluripotentes induites et test de phagocytose in vitro sur cellules vivantes à l’aide de synaptosomes humains.J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre la procédure de différenciation des cellules pluripotentes humaines en cellules de type microglie. Le processus consiste à former des corps embryoïdes, à les transférer dans des puits enrobés et à utiliser des facteurs de croissance spécifiques pour guider la différenciation en précurseurs primitifs de macrophages, qui se différencient finalement en cellules de type microglie.

Protocole

1. Différenciation de la microglie

REMARQUE : La figure 1 résume une vue d’ensemble du protocole.

1. Culture de cellules souches pluripotentes induites (iPSC)
   note: De plus amples détails décrivant les techniques de culture d’iPSC peuvent être trouvés ailleurs.
   1. Décongélation et entretien
      1. Préparez le milieu iPSC, aliquotez-le et conservez-le à -20 °C jusqu’à 6 mois. Décongelez les aliquotes pendant la nuit à 4 °C et utilisez-les jusqu’à 1 semaine. Laissez le support à température ambiante pendant au moins 1 h avant de l’utiliser.
      2. Enduisez les puits d’une plaque à 6 puits en ajoutant 1 mL de 10 μg/mL de laminine 521 diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) contenant du calcium et du magnésium. Conservez les plaques dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant au moins 2 h ou de préférence toute la nuit. Une fois diluée, conservez la laminine à 4 °C pendant 3 mois.
      3. Préparez une solution mère de 10 mM d’inhibiteur de Rho kinase Y27632 (inhibiteur de ROCK) en la diluant dans de l’eau stérile. Préparez des aliquotes à usage unique de solution d’inhibiteur de ROCK et conservez-les à -20 °C jusqu’à 1 an.
      4. Préparer 0,5 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) en diluant la solution mère de 0,5 M d’EDTA dans du DPBS.
      5. Pour décongeler un flacon d’iPSC congelés, placez le flacon dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il soit presque décongelé. Transférez immédiatement le contenu du flacon dans un tube conique de 15 mL contenant 4 mL de milieu iPSC. Centrifuger à 500 × g pendant 1 min.
      6. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension en ajoutant lentement 1 mL de milieu iPSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK contre la paroi du tube pour éviter de perturber les colonies.
      7. Ajouter 1,5 mL de milieu iPSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK dans chacun des puits enrobés et transférer les colonies remises en suspension goutte à goutte dans les puits contenant le milieu.
         note: Utiliser 5 à 7 gouttes de l’étape 1.1.1.6 pour l’entretien de la culture, mais ajuster la densité de semis optimale pour chaque lignée iPSC.
      8. Répartissez uniformément les cellules dans les puits en déplaçant manuellement la plaque d’un côté à l’autre et d’arrière vers l’avant. Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂. Le lendemain, remplacez complètement le milieu par l’ajout d’un milieu iPSC frais sans inhibiteur de ROCK.
      9. Pour l’entretien, changez de milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % de confluence.
         note: Les cellules peuvent être maintenues sans changer de milieu pendant 2 jours si le milieu iPSC utilisé permet un horaire d’alimentation flexible. Il est conseillé de limiter cela à une fois par passage et seulement si les cellules sont confluentes à moins de 50 %.
   2. Fractionnement
      1. Aspirez le milieu et lavez les cellules avec 1 mL de DPBS (sans calcium ni magnésium).
      2. Pour déloger les cellules, ajoutez 1 mL d’EDTA 0,5 mM et incubez pendant 2-3 min à température ambiante jusqu’à ce que les bords des colonies cellulaires se soulèvent de la surface du puits. Lavez de nouveau les cellules avec du DPBS et ajoutez 1 mL de milieu iPSC.
      3. Dissociez les colonies cellulaires en les grattant doucement à l’aide d’un lève-cellule. Ne grattez qu’une seule fois chaque zone du puits pour éviter de déranger les colonies.
         note: D’autres méthodes pour déloger les colonies du puits peuvent être trouvées ailleurs.
      4. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml, prélever les cellules et les transférer goutte à goutte dans un rapport de 1:6 (cellules par rapport au milieu) dans des puits pré-enrobés (comme mentionné à l’étape 1.1.1.2) contenant 1,5 ml de milieu iPSC.

2. Différenciation des iPSC en cellules de type microglie (iMGs)

REMARQUE : Les petites molécules et les facteurs de croissance sont dissous dans de l’albumine sérique bovine à 0,1 % filtrée stérilement dans le DPBS à une concentration de base 1 000 fois supérieure à la concentration finale. Il est recommandé de différencier les iPSC en iMG lors des premiers passages. Un caryotypage régulier des lignes iPSC est conseillé.

1. Préparer une solution de revêtement standard
   1. Décongeler la solution mère d’un réactif d’enrobage de matrice extracellulaire sur de la glace à 4 °C pendant la nuit.
   2. Prérefroidissez les tubes de microcentrifugation et les pointes de pipette de filtre à 4 °C.
   3. Aliquote 250 μL du réactif d’enrobage de matrice extracellulaire concentré dans chaque tube et placer immédiatement sur de la glace. Stockez les aliquotes à -20 °C.
   4. Pour préparer la solution d’enrobage, décongelez l’une des aliquotes de réactifs d’enrobage de la matrice extracellulaire sur de la glace à 4 °C pendant la nuit.
   5. Ajoutez 50 ml de milieu glacé Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient mixture F12 (DMEM-F12) optimisé pour la croissance d’embryons humains et de cellules souches pluripotentes induites (appelé DMEM-F12) dans un tube conique prérefroidi et conservez-le sur de la glace.
   6. Refroidissez une pointe de pipette de 1 mL en pipetant le DMEM-F12 glacé de haut en bas à plusieurs reprises, puis utilisez immédiatement la pointe de la pipette pour transférer 250 μL du réactif de revêtement de matrice extracellulaire dans le tube conique contenant le milieu DMEM-F12.
      note: La solution de revêtement standard peut être conservée pendant 2 semaines à 4 °C.
2. Formation du corps embryoïde (EB)
   1. Préparez un milieu EB qui peut être maintenu à 4 °C jusqu’à 4 jours.
   2. Une fois que les iPSC ont atteint une confluence de 80 %, dissocier les colonies en les lavant avec 1 mL de DPBS et en ajoutant 1 mL d’un réactif de dissociation pendant 2 min à 37 °C. Déloger les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules en grattant plusieurs fois pour créer une suspension unicellulaire. Recueillez les cellules et transférez le tout dans un tube conique de 15 ml contenant 9 ml de DPBS.
   3. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant 1 min, retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu EB. Prélever 10 μL de cellules et diluer 1:1 avec du bleu de trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre et, en fonction du nombre de cellules, diluez le stock de cellules jusqu’à une dilution finale de 10 000 cellules par 100 μL. Pour le placage des cellules, ajoutez 100 μL des cellules diluées par puits dans une plaque à 96 puits à fond rond à faible adhérence.
      note: En général, 48 puits de la plaque de 96 puits peuvent être obtenus à partir de chaque puits confluent à 80 % de CSPi.
   4. Centrifuger la plaque à 125 × g pendant 3 min et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 4 jours. Effectuez un changement de demi-milieu le jour 2 à l’aide d’une pipette multicanaux et en prélevant délicatement 50 μL d’ancien milieu, puis en ajoutant à nouveau 50 μL de milieu EB frais.
      note: Le jour 4, les iPSC formeront des structures cellulaires sphériques appelées EB, comme décrit dans la section des résultats. Le processus de différenciation EB peut être prolongé jusqu’à 7 jours, si nécessaire.
3. Génération de précurseurs primitifs de macrophages (PMP)
   1. Préparez un milieu de base PMP, un filtre stérile, et conservez-le à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   2. Enduisez les puits d’une plaque à 6 puits en ajoutant 1 mL de solution d’enrobage Matrigel glacée et incubez à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant au moins 2 h ou de préférence toute la nuit.
   3. Au jour 4 de la différenciation des EB, transférez les EB dans les puits recouverts de Matrigel en recueillant les EB avec des pointes de pipette de 1 mL (à l’aide d’une pipette). Pipetez de haut en bas une ou deux fois pour déloger les EB du puits. Tenez la plaque à 6 puits à un angle incliné pour permettre aux EB de se déposer au bord du puits.
      note: Neuf ou dix EB peuvent être plaqués par puits revêtu.
   4. Une fois que tous les EB se sont déposés, pipetez doucement et retirez l’ancien milieu à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL tout en gardant les EB au bord du puits. Ajouter 3 ml de milieu complet PMP fraîchement préparé dans chaque puits. Répartissez uniformément les cellules dans les puits en déplaçant manuellement la plaque d’un côté à l’autre et d’arrière vers l’avant. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
   5. Ne dérangez pas la plaque pendant 7 jours pour permettre aux EB de se fixer au fond du puits. Après ce délai, effectuez un changement de demi-médium à l’aide du milieu complet PMP.
      note: À ce stade, la plupart des EB doivent être fixés à la plaque. Tous les EB flottants peuvent être supprimés.
   6. Après 5 à 7 jours, inspectez les EB sous un microscope à champ lumineux à un grossissement de 4x pour vous assurer qu’ils sont fixés au fond des puits. Changez de support comme décrit à la section 1.2.3.5. Le jour 21, effectuez un changement complet de milieu avec 3 ml de milieu complet PMP.
      note: Les progéniteurs myéloïdes flottant dans le milieu peuvent être évidents à ce stade. Ces cellules doivent être éliminées lors du changement de milieu.
   7. Le 28e jour, rechercher des cellules rondes appelées PMP dans le surnageant et prélever le milieu contenant les PMP à l’aide d’une pipette de 10 mL et d’un pipetteur automatique. Veillez à ne pas déranger les EB. Transférez les PMP et le milieu dans un tube conique de 15 mL et procédez comme décrit à l’étape 1.2.4.
      note: Habituellement, les PMP d’une même ligne iPSC peuvent être collectés à partir de cinq puits d’une plaque de 6 puits et regroupés dans un seul tube conique de 15 ml.
   8. Ajouter 3 mL de milieu complet PMP frais pour un entretien ultérieur des EB. Comme les PMP émergent continuellement des EB pendant plus de 3 mois, collectez-les tous les 4 à 7 jours (ne laissez pas le milieu changer de couleur pour devenir jaune) comme décrit aux étapes 1.2.3.7 et 1.2.3.8.
      note: Bien que les PMP puissent être collectés pendant plusieurs mois, ils peuvent changer de phénotype avec le temps.
4. Différenciation par rapport aux iMG
   1. Préparez le milieu de base iMG (Table des matériaux), le filtre stérile et conservez-le à 4 °C jusqu’à 3 semaines.
   2. Une fois que les PMP ont été rassemblés dans un tube conique de 15 mL, les centrifuger à 200 × g pendant 4 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les PMP à l’aide de 1 à 2 mL de milieu basal iMG. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre en prélevant une petite aliquote et en diluant 1:1 avec Trypan blue.
      REMARQUE : 0,5-1,5 × 10⁶ PMP sont normalement obtenus chaque semaine en fonction de la lignée iPSC et de l’âge de la culture EB.
   3. Centrifuger à nouveau le reste des cellules à 200 × g pendant 4 min. Diluer les PMP à la concentration souhaitée de sorte que les cellules soient plaquées à une densité de ~10⁵/cm² sur des plaques traitées en culture cellulaire à l’aide d’un milieu complet iMG fraîchement préparé. Effectuez un changement de demi-milieu à l’aide d’un milieu complet iMG fraîchement préparé tous les 3 à 4 jours pendant 10 à 12 jours pour permettre la différenciation terminale.
      note: À ce stade, les cellules devraient acquérir une morphologie semblable à celle de la microglie. Pour confirmer l’engagement des PMP dans le devenir de la microglie, une analyse d’immunofluorescence est effectuée pour corroborer l’expression de marqueurs enrichis en microglie tels que le récepteur purinergique P2RY12 et la protéine transmembranaire 119 (TMEM119).
   4. Pour préserver la santé et la viabilité cellulaires, effectuez toutes les expériences entre les jours 10 et 12 de la différenciation de l’iMG.

Résultats

Figure 1 : Schéma du protocole de différenciation des iPSC en cellules de type microglie.Le jour 0, une fois que les iPSC ont atteint 80 % de confluence, les colonies sont dissociées en cellules uniques et cultivées dans un milieu EB pour induire la formation d’EB. Le jour 4, les EB sont collectés et conditionnés dans un milieu PMP pour induire la génération de PMP. Après 28 jours, les PMP ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériaux de culture cellulaire
Plaques à 6 puits	Greiner Bio-One	Référence 657160
100 mm x 20 mm Traité pour la culture tissulaire	CELLTREAT	Référence 229620
Lève-cellules, double extrémité, lame plate et lame étroite, stérile	CELLTREAT	229305
Plaque à fond rond à 96 puits à faible adhérence	Corning	N° 7007
Plaque de culture cellulaire multipuits modifiée à 24 puits à surface inférieure plate Primaria	Corning	353847,
Plaque de culture multipuits à 6 puits à 6 puits, transparente à fond plat et modifiée par Primaria	Corning	353846
Microplaque à fond plat transparent 96 puits Primaria	Corning	353872
Réactifs de dissociation cellulaire
Accutase	Corning	Référence 25058CI	Réactifs de dissociation utilisés pour la différenciation des motoneurones inférieurs
Réactif TrypLE	Technologies de la vie	Tél. : 12-605-010	Réactifs de dissociation utilisés pour la différenciation de la microglie
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
Réactifs d’enrobage pour la culture cellulaire
Matrigel GFR Matrice membranaire	Corning™	Référence 354230	Appelé réactif de revêtement de matrice extracellulaire
Laminine CellAdreach-521	Technologie STEMCELL	Référence 77004	Désigné comme laminine 521
Poly-D-lysine	sigma	P7405	Reconstituer à 0,1 mg/mL dans un tampon de borate
Poly-L-Ornithine	sigma	Réf. P3655	Reconstituer à 1 mg/mL dans un tampon de borate
Composants des supports iPSC
Kit mTeSR Plus	Technologie STEMCELL	Référence 100-0276	Pour préparer le média iPSC, mélangez les composants 1x
Composants des milieux EB
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	Concentration finale 50 ng/mL
Médias iPSC			Concentration finale 1x
Inhibiteur de ROCK Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	Concentration finale 10 μM
Scf	PeproTech	Référence 300-07	Concentration finale 20 ng/mL
Le VEGF	PeproTech	100 à 20 A	Concentration finale 50 ng/mL
Composants du support de base PMP
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentration finale 1x
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentration finale 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	Concentration finale 1x
Composants du média complet PMP
55 mM de 2-mercaptoéthanol	Gibco	21985023	Concentration finale 55 μM
L’IL-3	PeproTech	Référence 200-03	Concentration finale 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentration finale 100 ng/mL
Média de base PMP			Concentration finale 1x
Composants du support de base iMG
DMEM/F12 avancé	Gibco	12634010	Concentration finale 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentration finale 1x
Supplément N2, 100x	Gibco	Référence 17502-048	Concentration finale 1x
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140122	Concentration finale 100 U/mL
Composants du média complet iMG
55 mM de 2-mercaptoéthanol	Gibco	21985023	Concentration finale 55 μM
L’IL-34	PeproTech ou Biologend	200-34 ou 577904	Concentration finale 100 ng/mL
Supports de base iMG			Concentration finale 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	Concentration finale 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	Concentration finale 50 ng/mL
Composants des supports de base à induction
DMEM/F12 avec HEPES	Gibco	11330032	Concentration finale 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Concentration finale 1x
Supplément N2, 100x	Gibco	Référence 17502-048	Concentration finale 1x
Acides aminés non essentiels (NEAA), 100x	Gibco	11140050	Concentration finale 1x
Composants du média d’induction complet
Composé E	Calbiochimie	Référence 565790	Concentration finale 0,2 μM et reconstitution du réactif matière à 2 mM dans de l’éthanol 1:1 et du DMSO
Doxycycline	sigma	D9891	Concentration finale 2 μg/mL et réactif de reconstitution à 2 mg/mL dans le DPBS
Média à base d’induction			Concentration finale 1x
Inhibiteur de ROCK Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	Concentration finale 10 μM
Autres réactifs de culture cellulaire
Trypan Blue, solution à 0,4 %	AMRESCO INC	K940-100ML
Albumine sérique bovine (BSA)	sigma	Référence 22144-77-0
DPBS avec Calcium et magnésium	Corning	Référence 21-030-CV
DPBS sans calcium ni magnésium	Corning	21-031-CV	Désigné par DPBS
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	Appelé DMEM-F12 optimisé pour la croissance des cellules souches embryonnaires humaines et pluripotentes induites
Protéine de souris laminine, naturelle	Gibco	23017015	Appelé laminine