Etablissement d’une culture de cellules gliales de Müller obtenue à partir de rétines de souris

Avertissement : Toutes les procédures impliquant le prélèvement d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.

1. Dissociation de la rétine

REMARQUE : Toutes les étapes suivantes (jusqu’à la récolte des cellules) doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité (BSC) A2 ou B2.

1. Préparez le mélange de dissociation Papain/DNase I comme suit.
   1. Pour six rétines, ajouter 75 μL de DNase I dans le tube contenant 750 μL de papaïne et mélanger soigneusement (mélange de dissociation).
   2. Pour la préparation individuelle des échantillons requise pour ce protocole, diviser le volume total de 825 μL en trois aliquotes : 275 μL du mélange dans un tube de 1,5 mL par souris (deux rétines). Calculez les quantités requises de DNase I et de Papain en conséquence.
      note: Jusqu’à six rétines peuvent être dissociées dans un tube de mélange Papain/DNase I. Cependant, la préparation des échantillons individuels permet de réduire le nombre d’agglomérations et d’améliorer la croissance cellulaire par rapport aux échantillons combinés.
2. Transférez deux rétines dans le mélange de dissociation Papain/DNase I. Utilisez une pipette de transfert avec un diamètre de pointe élargi, prélevez les rétines, attendez que les rétines se déposent au bas de la pointe, puis libérez les rétines sans excès de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) dans le tube contenant le mélange Papain/DNase I.
3. Placez-le sur un nutator et incubez-le pendant 10 min dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂).
4. Dissociez les cellules en pipetant soigneusement de haut en bas (environ 20 à 30 fois) avec une pipette de 1 ml. Une fois que les cellules se sont dissociées (c’est-à-dire qu’elles ont donné une solution homogène sans morceaux), ajoutez 275 μL d’inhibiteur de protéase ovomucoïde du kit de dissociation de la papaïne pour neutraliser la papaïne. Mélangez doucement en pipetant de haut en bas. REMARQUE : Si six rétines ont été dissociées dans 825 μL de mélange Papine/DNase I, 825 μL d’Ovomucoid sont nécessaires.
5. Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
6. Ajouter le facteur de croissance épidermique (EGF, 1 μL par 1 mL de milieu de croissance, reconstitué à 200 μg/mL dans du PBS) au volume calculé de milieu de croissance (1 mL par souris) préchauffé à 37 °C.
   REMARQUE : Selon le plan expérimental, le marqueur de prolifération 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), ainsi que le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) ou d'autres facteurs requis peuvent être ajoutés au début de la période de culture.
7. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse. Ne touchez pas la pastille au fond du tube.
8. Retirez le surnageant avec précaution et entièrement. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 500 μL de milieu de croissance enrichi en EGF.
9. Transférez la suspension cellulaire dans un puits de la plaque à 12 puits étiquetée (figure 1C). Rincer le tube avec 500 μL supplémentaires de milieu de croissance enrichi en EGF et l’ajouter dans le puits (volume total de 1 mL par puits).
10. Répétez les étapes 1.8 et 1.9 avec tous les autres échantillons.
11. Secouez la plaque du puits trois fois avec précaution (d’avant en arrière, à gauche et à droite). Placez la plaque dans l’incubateur (37 °C, CO₂).
    note: Si des souris transgéniques sont utilisées, effectuez le génotypage de chaque animal (figure 1D). Identifiez les souris positives et négatives à la recombinase Cre et étiquetez la plaque en conséquence. Pour ce protocole, seules des cellules de souris rapporteures positives à la recombinase Cre ont été utilisées pour les étapes suivantes. Les cellules des échantillons négatifs Cre sont congelées et utilisées pour d’autres applications.

2. Phase de croissance

REMARQUE : La phase de croissance dure environ 4 à 5 jours (Figure 2B). Pour ajouter des liquides dans des puits contenant des cellules, la pipette doit pointer vers la paroi du puits et le liquide doit être libéré lentement pour éviter le détachement des cellules. Ne pipetez pas directement sur les cellules.

1. Un jour après la dissociation, retirer le milieu et ajouter 1 mL de milieu de croissance frais supplémenté en EGF.
2. Le jour 3, retirez le milieu et ajoutez 1 mL de HBSS (température ambiante) pour éliminer les débris cellulaires. Balancez-vous doucement d’avant en arrière de gauche à droite. Retirez le HBSS, répétez l’étape de lavage et ajoutez 1 ml de milieu de croissance préchauffé supplémenté en EGF.
3. Surveillez les cellules tous les jours et évaluez leur état de croissance jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 90 % à 100 %. La figure 3 montre un exemple de bonne croissance de la MG au fil du temps. Vérifiez qu’il n’y a pas de contamination ou de mort cellulaire. Jetez les cultures contaminées.
   note: Pour surveiller et enregistrer l’état des cellules, prenez des images à différents grossissements à l’aide d’un microscope optique avec une caméra connectée et des objectifs 4x, 10x ou 20x. Dans cette étude, un microscope à fluorescence est utilisé.

3. Préparation des lamelles avec de la poly-L-ornithine (Poly-O) et une couche de laminine

REMARQUE : Cette étape n’est nécessaire que si un marquage immunofluorescent et une microscopie confocale à balayage laser sont effectués. Des lamelles rondes en verre (12 mm de diamètre) sont nécessaires pour une bonne imagerie. Le protocole de revêtement se trouve également dans la fiche technique du milieu neuronal (voir Tableau des matériaux).

1. Placez soigneusement des lamelles stériles au centre de chaque puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’une pince stérile Dumont #2AP.
   note: Placez les lamelles au centre du puits. Placer des lamelles près de la paroi d’un puits entraînera des problèmes de tension superficielle pour les étapes suivantes.
2. Décongelez une aliquote Poly-O de 2,5 mL à température ambiante et placez-en 100 μL au centre de chaque lamelle.
3. Incuber la plaque de puits pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C.
4. Retirez Poly-O et lavez le puits avec la lamelle trois fois avec ~1 mL d’eau stérile.
5. Laissez sécher la plaque du puits pendant la nuit dans le BSC. Décongeler 2,5 mL de laminine à 4 °C pendant la nuit.
6. Le lendemain matin, ajoutez 100 μL de laminine au centre de chaque lamelle et incubez pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C.
7. Retirez la laminine soigneusement et entièrement.
8. Maintenez la plaque à 4 °C si le passage ne peut pas être effectué immédiatement.
   note: Les lamelles revêtues dans les plaques préparées peuvent être conservées pendant quelques jours à 4 °C.

4. Passage cellulaire pour éliminer les survivants neuronaux

REMARQUE : Le passage cellulaire est nécessaire pour éliminer les cellules neuronales, pas pour augmenter la population cellulaire. La glie ne se divise que quelques fois et ne se développera plus après le passage. Ne diluez pas les suspensions cellulaires. Les cellules d’un puits confluent d’une plaque de 12 puits peuvent être distribuées sur un puits d’une plaque de 12 puits ou sur deux puits d’une plaque de 24 puits. Lorsque des lamelles recouvertes sont utilisées, seulement environ un tiers de la lamelle est revêtue. Par conséquent, six lamelles situées dans une plaque de 24 puits, avec des cellules confluentes (~80 %-90 %) peuvent être obtenues à partir d’un puits de cellules confluentes d’une plaque de 12 puits. D’autres ratios peuvent également être choisis pour augmenter ou diminuer la densité cellulaire. Pour ce protocole, une souris rapporteure Cre+ est utilisée [une expérience, deux traitements : miR-25 ou control-miR ; réplicats techniques n = 3 (trois lamelles par traitement), réplica biologique n = 1]. Le nombre de répétitions techniques et biologiques peut être défini différemment selon le plan d’expérience.

1. Vérifiez si les cellules sont confluentes à 90 % à 100 % (également à la marge du puits ; Figures 3E, F).
2. Retirer le milieu et ajouter 1 mL de HBSS (température ambiante) pour laver. Balancez doucement l’assiette (d’avant en arrière, de gauche à droite). Retirez complètement HBSS.
3. Ajouter 500 μL d’une solution préchauffée contenant de la trypsine (préchauffée à 37 °C dans un bain de billes métalliques) pour détacher les cellules du puits. Balancez-vous doucement (d’avant en arrière, de gauche à droite) et incubez pendant 2 min dans un incubateur à 37 °C.
4. Déplacez la plaque de l’incubateur vers l’ESB. Pendant l’inclinaison, aspirez la solution contenant de la trypsine et dispersez-la soigneusement et lentement sur le puits plusieurs fois jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement. Tenez la plaque contre la lumière et assurez-vous qu’il ne reste aucune cellule au fond.
5. Transférez cette suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 8 min à 4 °C.
6. Retirez le surnageant et remettez soigneusement la pastille en suspension en ajoutant 600 μL (100 μL par puits pour 6 puits/lamelles) de milieu de croissance préchauffé (complété par EGF ; 1:1000). et en pipetant de haut en bas ~30-40 fois.
   note: Les cellules peuvent être congelées à ce moment à -80 °C ou dans de l’azote liquide et décongelées selon les protocoles standard de décongélation des lignées cellulaires. Si les cellules sont congelées, elles ne seront pas remises en suspension dans un milieu enrichi en EGF (milieu de croissance). Ils seront remis en suspension dans un milieu basique (sans EGF) et une solution de congélation (rapport 1/1).
7. Ensemencez les cellules en plaçant 100 μL de la suspension de 600 μL au centre de six lamelles enrobées (voir l’étape 5) de la plaque à 24 puits. Placez soigneusement la plaque dans l’incubateur et laissez les cellules se déposer.
   REMARQUE : 100 μL de la suspension cellulaire de 600 μL (récoltée dans un puits d’une plaque de 12 puits) entraîneront une confluence cellulaire de 90 % à 100 %, ce qui est nécessaire pour la transfection.
8. Vérifiez les cellules après 3 h pour voir si elles se sont déposées sur la lamelle. Ajouter 400 μL de milieu de croissance complété par EGF.
   REMARQUE : Les cellules sont généralement prêtes pour la transfection le lendemain (Figure 3G). S’ils ne sont pas confluents (90 % à 100 %), laissez-les pour un autre jour. S’ils ne sont toujours pas confluents, ne les utilisez pas pour la transfection. Si d’autres applications en aval sont menées, telles que le profilage des miARN, le RNA-Seq, le RT-qPCR ou le western blot, les cellules doivent être passées dans des plaques à 12 puits (rapport 1:1 ; aucun traitement de plaque requis) et récoltées pour l’extraction de l’ARN/protéine.

Graphique 1 : Dissociation rétinienne et génotypage. (A) Œilleton avec cornée, cristallin, iris et vitré enlevés. (B) Rétines isolées ; Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) sont éliminées après un lavage minutieux. (C) Plaque à 12 puits avec rétines dissociées (deux rétines par puits). (D) Découpe d’un exemple d’image de génotypage en gel. Le génotypage est nécessaire pour identifier les souris qui ont l’expression de la recombinase Cre induite par Ascl1 et sera utilisé pour suivre la conversion cellulaire. Barres d’échelle : 1 mm.

Graphique 2 : Conception expérimentale et parcours temporel d’une culture primaire de glie de Müller. (A) Schéma de la souris Ascl1CreERT :tdTomatoSTOPfl/fl, une souris rapporteure progénitrice rétinienne utilisée pour suivre la conversion de la glie de Müller (MG) en cellules progénitrices rétiniennes (RPC). (B) Déroulement temporel des périodes de culture comprenant la phase de croissance (bleu, 0-4/5 jours in vitro, div), la phase de transfection (violet, 5/6-7/8 div) et la phase de conversion MG (jaune, commence 7/8 div). Phase de croissance : les rétines dissociées (deux rétines d’une souris) sont cultivées dans un puits d’une plaque à 12 puits dans un milieu de croissance. Vers le 4/6e jour, les cellules sont passées dans une plaque à 24 puits qui contient des lamelles revêtues. Phase de transfection : 5 à 7 cellules div (1 jour après le passage) sont transfectées avec des miARN pendant 2 jours dans un milieu de transfection. La cre recombinase est activée avec le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT). La prolifération cellulaire est suivie avec EdU. La phase de conversion de la MG commence 1 jour après la transfection. Les cellules sont maintenant cultivées dans le milieu neuronal jusqu’à la récolte (6-7 jours après les transfections, dpTF).

Graphique 3 : glie de Müller primaire pendant la phase de croissance. (A) L’évolution temporelle des périodes de culture pendant la phase de croissance (0-4/5 jours in vitro (div)) est surlignée en bleu. (B-G) Images en direct (phase) de la glie de Müller (MG) pendant la phase de croissance après 1 div (B), 2 div après le changement de milieu (C), 3 div (D), 4 div avant passage (E,F) et 5 div, 1 jour après le passage et avant la transfection (G). Les corps cellulaires MG sont indiqués par des pointes de flèches rouges. Après 3 div, les cultures sont confluentes à 60 % à 80 % (D), après 4 à 5 div, les cultures sont confluentes à 90 % à 100 % et prêtes à être franchies (E-F). Après le passage sur les lamelles, les cultures cellulaires doivent être confluentes à 80 % à 90 % pour la transfection ultérieure (G). Barres d’échelle : 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F).