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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation du tampon
REMARQUE : Si vous effectuez un séquençage de l’ARN en aval, traitez soigneusement tous les espaces de travail et outils avec la solution de décontamination de la RNase pour éviter la dégradation de l’ARNm.
- Préparez le tampon de lyse.
- Dissoudre dans de l’eau distillée (H2O) jusqu’à 50 mL : 5,47 g de saccharose (0,32 M final), 250 μL de chlorure de calcium 1 M (CaCl2) (5 mM final), 150 μL d’acétate de magnésium 1 M (Mg(CH3COO)2) (3 mM final), 10 μL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 500 mM (0,1 mM final), 500 μL d’acide tris-chlorhydrique 1 M (Tris-HCl) (pH 8) (10 mM final), 50 μL de Triton X-100 (0,1 % final) et 17 μL de 3 M de dithiothréitol (DTT, 1 mM final, ajouter frais) (voir le tableau des matériaux).
- Préparer le tampon de saccharose
- Dissoudre dans du H2O distillé jusqu’à 50 mL : 30,78 g de saccharose (1,8 M final), 150 μL de 1 M Mg (CH3COO)2 (3 mM final), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL de 3 M DTT (1 mM final, ajouter frais).
2. Dissociation des tissus congelés en suspension mononucléusique
- Ajoutez 4 ml de tampon de lyse glacé dans un distributeur de mouchoir en verre de 7 ml (broyeur) et conservez sur de la glace. Disséquez environ 200 à 400 mg du cortex adulte humain fraîchement congelé, dénoncez environ 50 fois et transférez l’homogénat de tissu dans un tube en polypropylène ultracentrifuge de 12 ml.
- À l’aide d’une pipette de 5 ml, ajoutez 6,5 ml de tampon de saccharose glacé au fond du tube de l’ultracentrifugeuse, en prenant soin de ne pas perturber la couche entre le saccharose et l’homogénat tissulaire.
REMARQUE : Si vous traitez des échantillons supplémentaires, équilibrez soigneusement les tubes en fonction de leur poids en ajoutant un tampon de lyse supplémentaire à l’échantillon plus léger. Un équilibrage précis des tubes de l’ultracentrifugeuse est essentiel pour éviter d’endommager le rotor et assurer une rotation à la bonne vitesse.
3. Ultracentrifugation
- Ultracentrifuger le lysat à 24 400 tr/min (101 814 × g) pendant 1 h à 4 °C. Aspirer soigneusement le surnageant et les débris sans déranger la pastille.
note: Une pastille peut ne pas être visible si elle commence avec moins de 200 mg de tissu.
- Ajouter 600 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (sans calcium (Ca2+), magnésium (Mg2+)) dans les noyaux pastilles et incuber sur de la glace pendant 10 min avant de remettre en suspension.
- Pipette de haut en bas 50 fois pour remettre en suspension la pastille de noyaux sur de la glace.
- À l’aide d’un hémocytomètre, visualisez les noyaux intacts au microscope et assurez-vous que la concentration de la remise en suspension est supérieure à 10à 5 noyaux/mL avant de passer à l’étape suivante (combiner 10 μL des noyaux remis en suspension avec 10 μL de bleu de trypan).
4. Incubation des anticorps
- Pour immunomarquer l’échantillon pour le tri des noyaux activés par fluorescence (FANS), ajoutez 500 μL de la pastille d’échantillon remise en suspension, 490 μL de 1x PBS (sans Ca2+, Mg2+), 10 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 10 % (0,1 % final), 1 μL d’anticorps anti-NeuN de souris conjugué à AF(Alexa fluor)555 (NeuN-AF555, concentration finale 1:1000), et 1 μL d’anticorps anti-PAX6 de souris conjugué à l’allophycocyanine (PAX6-APC, concentration finale de 1:1000).
note: Des anticorps alternatifs conjugués à d’autres fluorophores peuvent être ajoutés. Ici, l’anti-OLIG2 de souris conjugué à AF488 (concentration de 1:1000) a été utilisé avec des résultats favorables.
- Effectuez des commandes 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) uniquement et monochromes pour configurer les paramètres de contrôle, en utilisant une petite quantité de l’échantillon si nécessaire.
- Pour effectuer un contrôle monochrome AF555, ajoutez 20 μL de pastille d’échantillon remise en suspension, 970 μL de 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libre), 10 μL de 10 % BSA (0,1 % final) et 1 μL d’anticorps NeuN-AF555 (concentration 1:1000).
- Pour effectuer un contrôle APC unicolore, ajoutez 20 μL de la pastille d’échantillon remise en suspension, 970 μL de PBS 1X (Ca2+, Mg2+ libre), 10 μL de BSA à 10 % (0,1 % final) et 1 μL d’anticorps PAX6-APC (concentration de 1:1000).
- Pour effectuer un contrôle DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) uniquement, ajoutez 20 μL de la pastille d'échantillon remise en suspension, 970 μL de 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libre) et 10 μL de 10 % BSA (0,1 % final) (DAPI sera ajouté ultérieurement, voir 4.4).
note: Si plus de deux anticorps sont utilisés, il est recommandé d’effectuer un contrôle de fluorescence moins un (FMO) en plus des contrôles monocolores.
- Incuber les échantillons et les témoins avec rotation dans l’obscurité pendant 1 h à 4 °C.
- Ajoutez DAPI au 1:1000 à tous les échantillons et contrôles, et procédez au tri.