Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Prélèvement de tissus
- Préparez le tampon X à partir du kit de dissociation neurale en ajoutant du bêta-mercaptoéthanol au tampon X jusqu’à une concentration finale de 0,067 mM (pour 4 échantillons, ajoutez 13,5 μl de 50 mM de bêta-mercaptoéthanol à 10 ml de tampon X).
- Préparez le mélange enzymatique 1 en mélangeant 50 μl d’enzyme P avec 1 900 μl de tampon X pour chaque échantillon, comme décrit dans le protocole du kit de dissociation neurale. Par exemple, pour 4 échantillons, mélangez 200 μl d’enzyme P avec 7 600 μl de tampon X.
- Placez le tampon X dans le bain-marie à 37 ºC.
- Placez 2 ml de solution de sel tamponné de Hank (HBSS) froide (sans Ca++ ni Mg++) dans un puits d'une plaque de culture stérile à 6 puits pour chaque échantillon qui sera prélevé et conservé sur de la glace pour la dissection tissulaire.
2. Dissociation neuronale (1 h)
- Coupez chaque échantillon de tissu en petits morceaux à l’aide de lames de rasoir stériles sur le couvercle de la plaque de culture à 6 puits. Ce protocole a été utilisé pour des échantillons de tissus d’environ 30 à 100 mg, mais il est approuvé pour des échantillons de tissus allant jusqu’à 400 mg. Pour les échantillons de tissus de plus de 400 mg, les volumes de réactifs doivent être augmentés de manière appropriée.
- À l’aide de 1 ml de HBSS frais sans Ca2+ et Mg2+, transférez les morceaux de tissu coupés en dés à l’aide d’une pipette dans un tube à centrifuger stérile de 2 ml. Répétez les étapes 2.1 et 2.2 pour tous les échantillons jusqu’à ce que tous les échantillons aient été transférés dans un tube à centrifuger de 2 ml.
- Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 2 min à RT et aspirer le surnageant.
- Ajouter 1 900 μl d’Enzyme Mix 1 chaud, tel que préparé aux étapes 1.2 et 1.3, à chaque échantillon et fermer les tubes.
- Incuber les échantillons pendant 15 minutes dans le bain-marie à 37 ºC, en inversant les tubes plusieurs fois toutes les 5 minutes pour remettre en suspension les morceaux de tissu déposés.
- Pendant ce temps, préparez le mélange d’enzymes 2 en mélangeant 20 μl de tampon Y avec 10 μl d’enzyme A décongelée (pour 4 échantillons, mélangez 80 μl de tampon Y avec 40 μl d’enzyme A décongelée).
- Ajouter 30 μl d’Enzyme Mix 2 à chaque échantillon et retourner doucement. Ne faites pas de vortex.
- Dissocier chaque échantillon de tissu à l’aide de la pipette Pasteur « 1 », en triturant de haut en bas 30 fois.
- Incuber les échantillons pendant 15 minutes dans le bain-marie à 37 ºC ; retourner les tubes plusieurs fois toutes les 5 minutes pour remettre en suspension les morceaux de tissu déposés.
- Dissociez chaque échantillon de tissu à l’aide de la pipette Pasteur « 2 », en triturant 30 fois de haut en bas, en évitant de générer des bulles.
- Dissociez chaque échantillon de tissu à l’aide de la pipette Pasteur « 3 », en triturant 30 fois de haut en bas, en évitant de générer des bulles.
- Incuber les échantillons pendant 10 min dans le bain-marie à 37 ºC ; retourner les tubes plusieurs fois toutes les 5 min pour remettre en suspension les cellules décantées.
- Appliquez une suspension unicellulaire sur une souche cellulaire de 80 microns placée sur un tube de faucon de 15 ml pour éliminer tous les gros débris et lavez le filtre et les cellules avec 10 ml de HBSS (avec Ca2+ et Mg2+) pour arrêter les réactions enzymatiques. Répétez l’opération jusqu’à ce que chaque échantillon soit transféré dans un tube faucon propre de 15 ml.
- Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min à RT et aspirer le surnageant.
3. Épuisement de la myéline (45 min)
- Remettez soigneusement en suspension la pastille de cellules avec 400 μl de tampon d’élimination de la myéline.
- Ajoutez une quantité spécifiée de billes d’élimination de la myéline et pipetez de haut en bas pour bien mélanger.
note: Le volume de billes d’élimination de la myéline utilisé dépendra de la taille du tissu, de l’âge de l’animal et de la quantité de myéline attendue dans cette région particulière du cerveau. Par exemple, pour un échantillon d’hippocampe de rat adulte (environ 300 mg), incubez l’échantillon avec 100 μl de billes d’élimination de la myéline.
- Incuber 15 min au réfrigérateur à 4 ºC.
- Lavez chaque échantillon avec 5 ml de tampon d’élimination de la myéline.
- Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min à RT.
- Pendant la centrifugation des échantillons, placez 1 colonne pour chaque échantillon dans le champ magnétique du trieur magnétique et placez un filtre propre de 80 microns sur chaque colonne.
- Préparez les colonnes et filtrez en rinçant chaque colonne avec 1 ml de tampon d’élimination de la myéline trois fois (3 ml au total). Recueillez tous les flux dans un conteneur à déchets, comme le fond d’une boîte de décharge vide.
- Placez un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml directement sous chaque colonne en préparation du prélèvement de l’échantillon.
- Lorsque les cellules ont terminé la centrifugation, aspirez le surnageant et remettez-le complètement en suspension dans 500 μl de tampon d’élimination de la myéline. Appliquez immédiatement la suspension cellulaire sur la colonne et collectez les cellules dans le tube situé en dessous.
- Lavez le filtre et la colonne avec 1 ml de tampon d’élimination de la myéline, 4 fois (4 ml au total).
- Centrifuger la collection de cellules à 300 x g pendant 10 min à RT.
- Aspirez le surnageant et les cellules sont maintenant prêtes pour la coloration.
4. Coloration des cellules vivantes pour FACS (1 heure pour la coloration)
- Vortex brièvement (2 sec) les cellules pour séparer la pastille et ajouter immédiatement 5 μl de bloc Fc (anti-clusters de différenciation 32, CD32), vortex à nouveau, et incuber au réfrigérateur à 4 ºC pendant 5 min.
- Pendant ce temps, préparez le mélange d’anticorps primaires en ajoutant les trois anticorps primaires dans le tampon de lavage comme suit : 0,125 μl d’anticorps CD11b conjugué à l’allophycocyanine (APC) (1:800), 1 μl d’anticorps anti-GLT1 (1:100) et 0,4 μl d’anticorps conjugué Thy1 isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (1:250) pour chaque 100 μl de tampon de lavage. Chaque échantillon recevra 100 μl de mélange d’anticorps primaires pour l’incubation ; Cependant, si votre échantillon est beaucoup plus grand que 400 mg de tissu, vous voudrez peut-être envisager d’augmenter le volume de votre mélange d’anticorps primaires en conséquence
- Préparez des tubes pour des contrôles de coloration unique en retirant seulement 2 μl de cellules de chaque tube d’échantillon et en les ajoutant à chaque tube de contrôle de coloration unique. Les témoins « à coloration unique » comprennent : APC-CD11b uniquement, GLT1 uniquement, FITC-Thy1 uniquement, anticorps secondaires PE uniquement et le contrôle « blanc » ou non coloré.
note: Tous les échantillons doivent être représentés dans tous les contrôles de coloration, donc 2 μl de cellules de chaque échantillon doivent être ajoutés à chaque tube de contrôle de coloration.
- Agitez brièvement les tubes (2 secondes) et ajoutez 100 μl de mélange d’anticorps primaires dans chaque tube d’échantillon et 100 μl d’anticorps primaires appropriés dans chaque tube de contrôle de coloration, agitez à nouveau les tubes, couvrez les tubes avec une feuille d’aluminium pour protéger les anticorps fluorescents de toute lumière, et incubez les tubes au réfrigérateur à 4 ºC pendant 20 min. Les échantillons doivent être conservés au frais (à 4 ºC) pour le reste de la procédure afin de maintenir l’intégrité des échantillons et des anticorps.
- Agitez brièvement les tubes et ajoutez 2 ml de tampon de lavage dans chaque tube.
- Tubes de centrifugation à 350 x g pendant 5 min à 4 ºC.
- Pendant ce temps, préparez le mélange d’anticorps secondaires en ajoutant 0,2 μl d’anticorps secondaire anti-lapin conjugué au PE pour 100 μl de tampon de lavage. Chaque échantillon recevra 100 μl de mélange d’anticorps secondaires ; Cependant, si votre échantillon est beaucoup plus grand que 400 mg de tissu, vous voudrez peut-être envisager d’augmenter le volume de votre mélange d’anticorps primaires en conséquence.
- Une fois la centrifugation terminée, versez le surnageant de chaque échantillon dans l’évier et épongez les tubes à l’envers sur une serviette en papier.
- Agiter brièvement les tubes et ajouter 100 μl de mélange d’anticorps secondaires dans chaque tube d’échantillon et l’anticorps secondaire approprié à chaque témoin de coloration. Ensuite, faites tourbillonner à nouveau les tubes, couvrez-les de papier d’aluminium et incuberez-les au réfrigérateur à 4ºC pendant 15 min.
note: Le tube de contrôle de coloration GLT1 uniquement doit recevoir le mélange d’anticorps secondaire.
- Après l’incubation, agitez brièvement les tubes et ajoutez 2 ml de tampon de lavage dans chaque tube.
- Centrifuger les tubes à 350 x g pendant 5 min à 4ºC.
- Une fois la centrifugation terminée, versez le surnageant de chaque échantillon dans l’évier et épongez les tubes à l’envers sur une serviette en papier.
- Agitez les tubes et ajoutez 0,25 ml de PBS stérile dans chaque tube. Les échantillons sont prêts à être triés.
note: Un plus grand nombre de cellules peut nécessiter 0,5 ml de PBS stérile ; Cependant, il est préférable de commencer avec un volume plus faible car l’échantillon peut toujours être dilué s’il est trop concentré avec des cellules.
note: En option, ajoutez de la DNase dans le tube pour éviter que les cellules ne s’agglutinent et n’obstruent ainsi le trieur. Les échantillons peuvent également être filtrés à l’aide d’un filtre stérile de 80 microns juste avant le tri pour éviter d’obstruer le trieur.
